Protomat S61 高精度电路板雕刻机(LPKF, 德国), 紫外曝光机(LPKF, 德国), MultiPress S液压层压机(LPKF, 德国)用于芯片加工; 42系列17_2212改进型步进电机(鼎智, 中国)自制步进电机配4支2 mL亚克力注射器(自制)和LVM10R1微型电磁阀(SMC, 日本)用于控制微流体流动; 810 nm发光二极管(Avago Technologies, 美国)作为检测光源, 硅光电二极管(TAOS, 美国)作为检测器。 3.0 mm GS 7C83染色聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)光学基片(Plexiglas GS, 德国)作为芯片基材; Norland 68光学胶(Norland, 美国)用于封接光学器件。

在实验中所有的溶液均由超声脱气后的18.2 MΩ 超纯水(由Milli-Q超纯水系统制得)配制; 硅标准溶液(1 L中含100 mg SiO₂, 国家标准物质研究中心); 酸性钼酸铵溶液: 将11.9 g钼酸铵(Aldrich, Sigma-Aldrich, 德国)溶于250 mL水中, 15 mL浓硫酸(优级纯, Merck, 德国)溶于150 mL水中, 冷却后两种溶液混匀。 掩蔽剂: 将26.3 g柠檬酸(Fluka, Sigma-Aldrich, 德国)溶于250 mL去离子水中, 再加入0.2 g酒石酸锑钾(Fluka, Sigma-Aldrich, 德国)充分溶解, 还原剂: 将10.0 g抗坏血酸(Fluka, Sigma-Aldrich, 德国)溶于200 mL去离子水中。 上述配置完成后各自加入1 mL氯仿, 使用前4 ℃冷藏避光保存, 有效期30 d。

本研究在《海洋监测规范》(17378.4— 2007)所述的硅钼蓝法基础上进行优化[图1(a)], 使之更适合在线分析的特点。 在酸性条件下, 海水中硅酸盐与钼酸铵混合反应生成黄色的硅钼杂多酸及硅钼黄, 以柠檬酸和酒石酸锑钾为掩蔽剂去除海水中磷和砷等物质的干扰。 研究显示^[10], 相较于国标法中的草酸, 柠檬酸和酒石酸锑钾具有掩蔽效果好, 不破坏硅钼黄且速度快的优点, 同时酒石酸锑钾也可对后续还原反应起到催化剂作用。 硅钼黄经掩蔽后与抗坏血酸反应生成硅钼蓝, 该物质在812 nm处有最大吸光度, 且其吸光度与浓度之间符合朗伯-比尔定律。

图1

Fig.1

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	图1 芯片设计及分析流程 PD: 光电二极管; Syr: 注射器; LED: 发光二极管; Abs. Cell Ref: 参比流通池; Abs. Cell Meas: 检测流通池; LT: 全反射光传输管Fig.1 Microfluidic chip design and analysis procedure PD: Photodiode; Syr: Syringe; LED: Light-emitting diode; Abs. Cell Ref: Adsorption cell reference; Abs. Cell Meas: Adsorption cell measurement, LT: Light tube

微芯片采用Protomat S61 高精度电路板雕刻机微铣刻制成[见图1(b)], 芯片基材为深棕色染色聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)光学基片, 尺寸为100 mm× 100 mm× 3.0 mm, 采用染色PMMA基材的目的是降低环境光以及参比光路的光源对检测的影响。 芯片采用氯仿溶剂辅助热压键合的方式, 前期研究显示^[11]该方式可有效降低微通道表面粗糙度, 提高光学分析精度。 芯片上设计了三个光学流通检测池, 其中两个25 mm长的检测池用于硅酸盐检测和参比, 一个5 mm长的检测池用于高浓度硅酸盐检测。 三组810 nm的LED和光电二极管作为光源和检测器, 直接以光学胶固定于光学检测池两端, 实现吸光度检测。 考虑到5 mm检测池光程较短, 光源会对检测器带来较大的影响, 因而在检测池和光源之间添加一段7 mm的微通道, 内灌入高折射率的光学胶(Norland Optical Adhesive 68)以形成具有全反射效应的光传输管(Light Tube)^[12], 用以增加光程, 降低强光LED对检测器的冲击。 同时, 芯片上设计了两个混合蛇形混合反应区, 长度分别为936.5和684.1 mm, 芯片上除检测池通道为400 μ m的正方形槽外, 其他通道均为250 μ m的正方形槽。 芯片上液体总死体积约123.7 μ L。

传感器[图2(a)和(b)]由四个部分构成, 包括流体驱动部分、 分析芯片、 相关控制分析电路以及传感器外设。 其中流体驱动部分由注射泵和电磁阀组组成, 注射泵采用直线步进电机配4只2 mL的PMMA注射器形式, 以两只近红外限位开关预先设定好注射器步进距离, 保证注射器在固定距离内往复运动, 稳定输送流体进入芯片。 流体进入芯片后, 由电磁阀组控制流体通断及转向, 电磁阀组由13只微型电磁阀(SMC公司, 日本)组成, 注射器和电磁阀采用螺纹和O型圈形式与芯片连接以保证水密性, 每个微电磁阀死体积约20 μ L, 因而整个芯片分析系统的总体积约383.7 μ L。 控制和分析电路系统包括中央数据处理模块、 电源模块、 步进电机控制驱动模块、 数据采集模块、 数据处理模块、 存储模块等部分构成。 中央处理器采用TI公司STM32芯片; 电源模块兼顾自容式供电和外部供电两种工作模式; 步进电机驱动模块采用鼎智DS-5045-003型驱动器, 实现电机往复运动; 数据采集模块主要完成光电二极管信号的采集、 转换、 放大, 采用24位德州仪器ADS1675作为A/D转换芯片; 数据处理模块对采集的信号进行实时量化、 通过积分和平均计算, 根据工作曲线关系, 进行实时输出处理数据; 存储模块采用2 GB的SD卡实现数据存储, 并设有容错程序文件, 保证传感器在意外断电时数据不丢失或损坏。 整个分析系统安装在一个直径15 cm, 长45 cm的PVC柱状桶中[图2(b)], 采用O型圈轴向密封, 同时传感器配有蠕动泵和0.45 μ m囊式过滤器的过滤装置以及分析所需的各种试剂袋。

图2

Fig.2

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	图2 传感器结构和实物图Fig.2 Construction model and real product of silicate sensor

传感器分析流程主要包括以下四步: (1)进样, 注射泵从抽取过滤后的海水样品并注入分析芯片中; (2)一次混合反应, 样品与酸性钼酸铵混合进入第一混合区反应。 形成硅钼黄; (3)二次混合反应, 硅钼黄形成后, 与掩蔽剂和抗坏血酸混合进入第二混合区显色; (4)测量吸光度, 计算硅酸盐浓度。 样品、 空白或标准物质进入芯片时要先测定参比吸光度, 用以后续校正样品基体误差; 样品与试剂以1∶ 1比例混合, 以80 μ L· min^-1的流速流过芯片系统, 为保证混合反应充分, 在样品进入一个混合区后, 关闭混合区后端电磁阀, 同时控制注射器来回抽动数次, 使混合区的两种液体做往复运动以提高混合反应效率, 考虑到硅钼黄反应速度较慢, 第一次混合后停留150 s以增强显色效果。 每次分析样品前后均需先测定空白样(人工海水)以确定仪器状态, 同时起到清洗系统的作用。 每个样品整个分析周期约(含分析前后空白样)300 s。 此外, 传感器原位测量时载带高低浓度的两种标准溶液(5和200 μ mol· L^-1)作为内标, 测量时每间隔15个样品左右分别自动测量一次, 以校正测量的准确度。

海水中可溶态硅的平均浓度约为36 μ mol· L^-1, 且含量变化很大。 在硅藻类浮游植物繁盛季节, 由于浮游植物大量摄取, 海水中硅酸盐浓度大大降低可达0.13 μ mol· L^{-1 [13]}, 而在大洋深水中其浓度约100~200 μ mol· L^-1, 如此大的浓度变化范围大大增加了硅酸盐现场分析的难度。 为兼顾高低浓度分析, 传感器分析芯片上采用25和5 mm两个测量光程分别实现高低浓度硅酸盐的分析, 工作曲线见图3(a)和(b)。 对于25 mm光程的检测池, 其在0~90 μ mol· L^-1的范围内有明显的浓度梯度, 但最佳线性测量范围为0~40 μ mol· L^-1, 其工作曲线回归方程为A=0.203c_Si+0.011 2(n=7, R²=0.998 4); 而对于5 mm光程的检测池, 其在0~800 μ mol· L^-1的范围内有明显的浓度梯度, 在0~400 μ mol· L^-1范围内呈线性, 其工作曲线回归方程为A=0.002 3c_Si+0.017 1(n=7, R²=0.998 5)。 为保证分析质量, 传感器在程序中设定当浓度低于30 μ mol· L^-1时以25 mm光程测量结果作为输出结果, 而高于30 μ mol· L^-1时采用5 mm光程测量结果, 总体线性测量范围为0~400 μ mol· L^-1。

图3

Fig.3

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	图3 传感器工作曲线 (a): 25 mm光程; (b): 5 mm光程Fig.3 Calibration of sensor (a): 25 mm optical path length; (b): 5 mm optical path length

连续测定硅酸盐浓度为7.7和132.1 μ mol· L^-1(以《海洋检测规范》硅钼蓝法测定)海水水样11次, 相对标准偏差(RSD%)分别为2.1%和1.4%, 显示了本传感器重复性良好, 精密度高。

以制备的无硅海水为空白样品, 连续测定11次, 以3倍空白样品标准偏差除以工作曲线斜率, 得到传感器得检出限为45.1 nmol· L^-1(25 mm光程)和1.6 μ mol· L^-1(5 mm光程), 以15倍空白样品标准偏差除以工作曲线斜率, 得到传感器得定量限为225.5 nmol· L^-1(25 mm光程)和8.0 μ mol· L^-1(5 mm光程)。

研究显示^[14], 采用硅钼蓝分析体系分析海水时主要干扰来自于磷酸盐(海水中砷酸盐含量很低, 可以忽略)和盐度。 其中磷酸盐干扰主要来自于磷酸盐与钼酸铵形成磷钼黄, 被抗坏血酸还原为磷钼蓝进而干扰硅钼蓝的检测, 本研究中加入柠檬酸和酒石酸锑钾作为掩蔽剂用以去除磷酸盐干扰; 而海水盐度变化对显色反应产生较大的影响, 海水中大量电解质的存在会加速β 型硅钼杂多酸(硅钼黄)向其同分异构体α 型硅钼杂多酸转化, 导致后续检测吸光度降低, 同时盐度也会在流动分析体系中产生Schlieren效应, 导致数据不稳定。 为此, 配置盐度为10, 15, 20, 30, 35, 40的10 μ mol· L^-1的硅酸盐样品, 考察盐度对分析准确性的影响(图4), 结果显示对于本传感器当盐度大于15时吸光度基本稳定, 不会影响测定准确度和稳定性。

图4

Fig.4

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	图4 海水盐度对传感器分析的影响Fig.4 Salinity effects on accuracy of sensor

以采自青岛中苑码头(120° 18″ E, 36° 03' N)和浙江舟山半升洞码头(122° 19' E, 29° 56' N)的海水水样为基底, 加入浓度50%和100%的硅酸盐标准液进行加标试验(表1), 结果显示, 传感器对高低硅酸盐本底浓度样品的加标回收率均在98.1%~104.0%之间, 表明其准确度良好。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 实际水样测定与基底加标回收率试验(n=3) Table 1 Determination of seawater sample and recovery tests (n=3) 水样 盐度 加标量 /(μ mol· L-1) 测定值 /(μ mol· L-1) 回收率 /% 中苑码头 30.1 0 1.7± 0.2 - 1.8 3.6± 0.1 103.1 3.6 5.2± 0.2 98.1 半升洞码头 25.4 0 62.3± 0.2 - 32.0 95.3± 0.5 101.1 64.0 131.3± 0.4 104.0

表1 实际水样测定与基底加标回收率试验(n=3) Table 1 Determination of seawater sample and recovery tests (n=3)

2015年11月29日起, 研究组搭载渔船对胶州湾南端, 青岛胶南海域的20个站点进行走航式调查[站位和航线见图5(a)]。 期间采用自主研制的硅酸盐传感器, 配在线0.45 μ m过滤装置对每个站点的硅酸盐进行表层1米原位测量(测量三次, 以平均值计), 同时采集海水样品带回实验室按照《海洋监测规范》开展分析比对。 表2显示了20个站点海水中的硅酸盐含量及其与国标法比对情况, 由表可知在给定的20个站点间, 传感器获取数据与国标法测定值变化趋势一致, 利用t检验法对所得硅酸盐数据进行显著性检验, 取α =0.05, n=3, 查表的t_{(α , f)}的临界值为2.776。 由于实验所得硅酸盐测试结果的t值均小于t_{(α , f)}的临界值, 可见传感器得到的测量结果与国标法测量值相比无显著性差异。

图5

Fig.5

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	图5 海试航线及海试区域硅酸盐浓度分布图(μ g· L-1)Fig.5 Sea trial route and silicate distribution around sea trial area (μ g· L-1)

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 硅酸盐海试数据及比对(n=3, μ g· L-1) Table 2 Silicate data from sea trial and comparison with national standard method(n=3, μ g· L-1) 站位 传感器测定值 实验室测定值 t检验 站位 传感器测定值 实验室测定值 t检验 HS01 51.2± 3.6 48.0± 1.2 0.218 2 ZY07 38.1± 0.1 37.8± 0.2 0.144 9 HS03 54.5± 3.0 54.3± 1.4 0.910 7 YZ01 51.6± 3.6 50.8± 0.3 0.714 0 HS04 48.7± 0.5 46.5± 0.7 0.012 2 J1 50.6± 0.6 49.1± 0.2 0.005 5 HS05 38.6± 0.8 37.4± 0.8 0.147 0 J2 46.9± 0.6 45.8± 0.8 0.135 6 HS06 32.2± 0.7 30.4± 0.8 0.042 8 J3 54.2± 0.9 53.1± 1.1 0.245 1 ZY02 48.6± 0.6 47.7± 0.8 0.200 2 J4 47.7± 0.5 46.3± 0.9 0.066 2 ZY03 49.9± 0.2 49.8± 0.2 0.629 3 J5 47.4± 0.5 45.8± 0.4 0.016 0 ZY04 46.8± 0.4 45.5± 0.5 0.024 9 J6 36.6± 1.1 35.6± 1.0 0.302 9 ZY05 53.9± 0.4 52.9± 0.2 0.013 2 J7 36.7± 0.5 35.2± 0.9 0.060 3 ZY06 69.1± 1.5 67.9± 0.7 0.262 2 J8 38.0± 0.5 36.7± 0.5 0.037 4

表2 硅酸盐海试数据及比对(n=3, μ g· L-1) Table 2 Silicate data from sea trial and comparison with national standard method(n=3, μ g· L-1)

就监测海域数据而言, 11月底胶州湾南端表层海水中硅酸盐的含量在32.2~69.1 μ g· L^-1之间, 平均值为47.1 μ g· L^-1。 最高值出现在前湾港区的ZY06站, 最低值出现在竹岔岛近海的HS06站, 平面分布[图5(b)]为近岸海域高于外海。