UV-2550紫外-可见分光光度计(日本岛津)、 Nano ITC等温滴定微量热仪(美国TA公司)、 C80微量量热仪(法国Setaram)。

粘虫DNA(按照酚-氯仿抽提法提取^[11])、 鲑鱼DNA、 小牛胸腺DNA(Sigma-Aldrich公司, 生物试剂)、 HPLC98%乌头碱(辰光生物科技有限公司)、 Tris-HCl缓冲溶液(pH7.4), 超纯水(ULUP-I-5/10/20T超纯水处理系统)。

1.2.1 微量量热法

乌头碱在水中的半衰期通过微量热法测定^{[12, 13]}, 采用动力学方程描述乌头碱在甲醇溶剂中的溶解速率。 根据下列动力学方程

dαdt=kf(α)(1)f(α)=(1-α)n(2)

其中α =H/H₀, 由式(1)和式(2)可得式(3)

ln1H0dHdti=lnk+nln1-HH0i(3)

该系统的反应级数(n)为斜率, 该系统的截距为lnk。 由此获得动力学方程(4), 乌头碱的半衰期由式(5)得到

dαdt=k(1-α)n(4)t12=ln2k(5)

式(5)适用于一级反应, k为反应速率常数。

1.2.2 紫外吸收光谱法

DNA浓度的测定: 取一定粘虫DNA经Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.4)稀释后进行紫外吸收测量, 参比为同体积的缓冲溶液。 小牛胸腺DNA和鲑鱼精DNA浓度测定同上。

乌头碱和DNA的相互作用测定: 取一定量DNA, 将浓度为1.07× 10^-3 mol· L^-1的乌头碱按一定量逐次滴加, 待反应5 min后进行紫外吸收测量。

1.2.3 等温滴定量热法

采用等温滴定量热技术, 确定反应的结合常数Ka、 结合位点数n、 反应焓变Δ H、 熵变Δ S, 用来表征分子间的相互作用^{[14, 15, 16, 17, 18, 19]}。 试剂均由脱气设备处理后使用。 25 ℃时, 样池中加入一定量DNA, 注射器中装有100 μ L乌头碱溶液; 参比池中加入同样池中等量的缓冲溶液。 经滴定量热实验可分别得到乌头碱与粘虫DNA、 鲑鱼精DNA、 小牛胸腺DNA的作用曲线。 使用NanoAnalyze软件将实验所得数据进行分析, 得到乌头碱滴定DNA的热力学参数。

1.2.4 分子模拟技术

使用Auto Dock Tools软件对小牛胸腺DNA晶体结构添加氢原子以及Gasteiger(电荷小牛胸腺DNA的晶体结构由RSCB Protein Data Bank获得)。

伪粘虫DNA和鲑鱼精DNA的构建如下: 由Sybyl 8.1软件的Biopolymer Build程序按照标准B型双链DNA结构进行构建^[20]。

伪粘虫DNA序列(由NCBI数据库获得):

ATGCCCCAACTCAACCCCGCCCCCTGATTTGCTATTTTAGTATTCTCATGACT

GGTTTTCCTAACTGTTATTCCTCCTAAAGTACTCGGCCACACCTTCACAAAT

GAGCCTACTTCACAAAGCACTGAAAAAGCTAAACCTGAACCCTGAAACTG

ACCAT GACACTAA

鲑鱼精DNA序列(由NCBI数据库获得):

ATGCCCCAACTCAACCCCGCCCCCTGATTTGCTATTTTAGTATTCTCATGACT

GGTTTTCCTAACTGTTATTCCTCCTAAAGTACTCGGCCACACCTTCACAAAT

GAGCCTACTTCACAAAGCACTGAAAAAGCTAAACCTGAACCCTGAAACTG

ACCAT GACACTAA

使用Powell方法, 分别对DNA添加电荷并进行能量最小化, 得到伪粘虫和鲑鱼精的DNA晶体图, 最终DNA的能量分别为-5.906× 10³和-6.358× 10³ kJ· mol^-1。

使用Auto Dock Tools软件对所构建的DNA晶体结构添加氢原子以及Gasteiger电荷。 乌头碱的结构由Sybyl 8.1软件进行构建, 添加Gasteiger Marsili电荷, 使用Tripos力场对结构进行最小化能量优化, 优化结构总能量为378.65 kJ· mol^-1, 使用AutoDock Tools软件对乌头碱分子的可旋转建进行分配。

分子对接^{[21, 22, 23, 24, 25]}, 使用AutoDock4.2软件对乌头碱分子与小牛胸腺DNA、 伪粘虫DNA、 鲑鱼精DNA分别进行分子对接, 分子对接位点的活性区域包含整个DNA分子, 活性区域大小为40× 40× 160 Å ³, 格点步长为0.375 Å 。 采用初始种群数为1 500的GA-LS算法, 进行50次运算, 最大传代数及能量收敛值分别为2.7× 10⁴和2.5× 10⁶。 通过基于小分子非氢原子的均方根偏差值(RMSD)对所得的50个聚类模式进行聚类分析, 分析所得个体数最大、 能量最低的结合模式作为乌头碱分子的结合位点。

采用实验方法1.2.1, 用C80微量量热仪(Setaram)得到实验数据如图1及表1所示。 其中, 反应池中依次加入30, 40, 50, 60 μ L浓度为8.55× 10^-6 mol· L^-1乌头碱的甲醇溶液和1.5 mL的纯水; 参比池中依次加入30, 40, 50和60 μ L甲醇与1.5 mL纯水。

图1

Fig.1

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图1 乌头碱放热速率的变化Fig.1 Heat release rate (dH/dt) in the entire reaction process of theaconitie

从表1可知, 乌头碱在纯水中的焓变不随乌头碱的量变而变, 因此其反应的摩尔焓变可用平均摩尔焓变替代, 即Δ H_{m, 纯水}为3.647× 10³ kJ· mol^-1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 乌头碱反应的焓变 Table 1 Enthalpy variation of aconitine in the entire reaction process 样品 体积/μ L 物质的量 n/mol 热量 Q/kJ 焓变Δ H/ (kJ· mol-1) 30 0.26× 10-6 -1.029× 10-6 -3.959× 103 40 0.34× 10-6 -1.194× 10-6 -3.514× 103 50 0.43× 10-6 -1.504× 10-6 -3.498× 103 60 0.51× 10-6 -1.784× 10-6 -3.498× 103

表1 乌头碱反应的焓变 Table 1 Enthalpy variation of aconitine in the entire reaction process

使用表1中的数据, 将物质n的量相对于热Q绘制, 并且所得图表示于图2中。

图2

Fig.2

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	图2 乌头碱(n)与热量Q的关系Fig.2 Relationship between the amount of aconitine (n) and the heat Q

图2显示了n和Q之间良好的线性关系, 反应的热释放随物质量的增加而增加。 将实验数据(dH/dt)_i和(H/H₀)_i写入式(1), 然后将ln[(1/H₀(dH/dt)_i]对ln[1-(H/H₀)_i]作图, 该反应级数n斜率, 截距为lnk, 最后反应级数(n)和k及其结果如表2所示。 k, n的平均值被写入动力学方程(4)。 得到乌头碱在水(pH 7.4) 中的反应动力学方程(6)

dαdt=2.78×10-4(1-α)1.1(6)

动力学方程(4)为准一级反应, 乌头碱的半衰期可以通过式(3)得到, 其值为t_1/2=0.691 h。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 20 ℃, 常压下乌头碱反应的动力学数据 Table 2 Kinetic data of the reaction of aconitine at 20 ℃ under atmospheric pressure V/μ L n/order k/s-1 r 30 1.20 3.50× 10-4 0.997 40 1.13 2.34× 10-4 0.999 50 0.95 3.36× 10-4 0.999 60 1.18 1.91× 10-4 0.999 Average 1.11 2.78× 10-4

表2 20 ℃, 常压下乌头碱反应的动力学数据 Table 2 Kinetic data of the reaction of aconitine at 20 ℃ under atmospheric pressure

2.2.1 DNA的浓度测法

(1) 常温下, 采用1.2.2之方法, 使用pH 7.4的Tris-HCl缓冲溶液, 将提取的粘虫DNA稀释至一定浓度, 使用UV-2550紫外可见分光光度计测量溶液在260和280 nm处的吸光度值(图3), 二者比值在1.8~1.9之间, 说明DNA的纯度达到实验要求; 用260 nm处的吸光度值(DNA在260 nm的摩尔吸光系数为6 600 mol^-1· cm^-1), 根据朗伯-比尔定律, 计算得到粘虫DNA的浓度。

图3

Fig.3

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	图3 粘虫DNA的紫外吸收光谱图Fig.3 UV-Vis absorption spectra of armyworm DNA

从图3可知, 粘虫DNA在260和280 nm处的吸光度分别为0.362和0.191, 则A₂₆₀/A₂₈₀=1.895此比值介于1.8和1.9之间, 说明粘虫DNA的纯度符合实验要求。 同时, 用260 nm处的吸光度计算得粘虫DNA浓度为5.17× 10^-5 mol· L^-1。

(2)鲑鱼精DNA、 小牛胸腺DNA的纯度及浓度测定

考虑到乌头碱对周围其他有益生物的影响, 在探究乌头碱对粘虫DNA的作用时, 也运用相同的方法分别探讨了乌头碱对鲑鱼精DNA, 小牛胸腺DNA的作用。 用紫外光谱法扫描鲑鱼精DNA储备液和小牛胸腺DNA储备液在 260 nm 处的吸光度值, 计算得到DNA的浓度: c_鲑鱼精DNA=5.17× 10^-5 mol· L^-1, c_{小牛胸腺DNA}=5.36× 10^-3 mol· L^-1。

2.2.2 紫外光谱法确定乌头碱与DNA作用类型

常温下, 利用1.2.2方法, 配制浓度为1.07× 10^-3 mol· L^-1的乌头碱溶液备用。 在样品池中分别加入上述三种DNA溶液各3 mL, 且依次加入5 μ L配制好的乌头碱溶液, 混合均匀并反应5 min测其紫外吸收变化, 参比池内为3 mL Tris-HCl缓冲溶液。 结果如图4所示。

图4

Fig.4

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	图4 乌头碱与DNA反应的紫外吸收谱图 (a): 粘虫DNA; (b): 鲑鱼精DNA; (c): 小牛胸腺DNAFig.4 UV-Vis absorption spectra of aconitine into DNA (a): DNA of Pseuo armyworm; (b): DNA of salmn sperm; (c): DNA of calfthymus

从图4可知, 随着乌头碱溶液浓度的增大, 粘虫DNA的紫外吸收图谱发生增色蓝移的现象, 同时发现, 鲑鱼精DNA、 小牛胸腺DNA的紫外吸收也发生了相同的变化, 即增色蓝移, 说明乌头碱与三种DNA的作用方式均为非经典嵌插。

2.2.3 ITC法乌头碱与DNA作用动力学

采用ITC法进行实验, 25 ℃下, 将4.50× 10^-4 mol· L^-1的乌头碱溶液取100 μ L置于注射器中, 样池中加入1 mL DNA溶液, 用乌头碱溶液滴定DNA, 每次滴加5 μ L共25次, 每次间隔400 s, 参比池中同样加1 mL Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.4)。 采用上述同样的方法用乌头碱溶液滴定缓冲溶液作为对照试验, 扣除稀释热。 结果如图5, 表3。

图5

Fig.5

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	图5 乌头碱滴定DNA的反应曲线 (a): 粘虫DNA; (b): 鲑鱼精DNA; (c): 小牛胸腺DNAFig.5 ITC data for aconitine into DNA (Tris-HCl, pH 7.40) at 25 ℃ (a): DNA of Pseuoarmyworm; (b): DNA of salmn sperm; (c): DNA of calf thymus

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 乌头碱和DNA反应的动力学参数 Table 3 Thermodynamic parameters of Aconitine-DNA System Ka/(L· mol-1) n Δ H/(kJ· mol-1) Δ S/(kJ· mol-1· K-1) Δ G/(kJ· mol-1) 粘虫DNA 1 1.29× 105 0.5 -37.14 -0.027 -29.17 2 1.00× 103 1.2 174.30 0.642 -17.05 鲑鱼精DNA 1 2.91× 105 0.6 -20.42 -0.011 -17.13 2 1.00× 103 7.1 136.00 0.344 33.61 小牛胸腺DNA 1 1.84× 105 0.4 -43.15 -0.037 -31.98 2 1.00× 103 2.9 34.06 0.172 -17.20

表3 乌头碱和DNA反应的动力学参数 Table 3 Thermodynamic parameters of Aconitine-DNA System

表3显示了一个有趣现象: 乌头碱对粘虫DNA、 鲑鱼精DNA、 小牛胸腺DNA作用时, 均呈现结合位点n₂大于n₁, Ka₁大于Ka₂的倾向。 说明第1类结合要比第2类结合稳定牢靠。 这是因为, 在第2类结合中, 药物分子仅与DNA表面发生作用而并未嵌到DNA分子的疏水部分, 由于作用物之间相互作用于表面, 容易形成较大的结合位点数, 但作用力分散亲合力较弱。 然而当药物小分子以非经典嵌入到DNA双螺旋结构并与碱基对相结合时, 则能成为较稳定的第1类结合。

对于第一类结合, Δ H₁< 0, Δ S₁< 0, Δ G₁< 0是一个放热明显的过程, 且结合平衡常数较大, 约为10⁵, 这可能是因为药物小分子和ctDNA的相互作用发生在沟槽区域, 表2中给出的两者反应的热动力学参数与文献报道的胡椒碱和ctDNA的相互作用的热动力学参数类似^[26], 因此可推测乌头碱结合在DNA的沟槽区, 且表现为焓驱动过程。

对于第二类结合, Δ H₂> 0, Δ S₂> 0 是吸热且熵增明显的过程, 结合平衡常数较小, 表明药物配体小分子只与DNA表面发生作用而未进入大分子内部, 故表现为熵驱动过程。

2.2.4 分子计算

采用1.2.4分子对接方法分别进行三种DNA和乌头碱分子的对接计算, 结果如图6、 表4所示。

图6

Fig.6

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图6 乌头碱分子与DNA的分子对接 (a): 伪粘虫DNA和乌头碱; (b): 鲑鱼精DNA和乌头碱; (c): 小牛胸腺DNA和乌头碱Fig.6 Docking results between Aconitine and DNA (a): DNA of Pseuo armyworm; (b): DNA of salmnsperm; (c): DNA of calfthymus

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 DNA和乌头碱的分子对接参数 Table 4 The molecular simulation results of Aconitine-DNA System 结合区 结合能/ (kJ· mol-1) 静电作用/ (kJ· mol-1) 氢键、 范德华力/ (kJ· mol-1) 氢键位置 粘虫DNA 沟槽 -17.71 -1.01 -32.94 T33 鲑鱼精DNA 沟槽 -17.71 -1.47 -33.49 T34 小牛胸腺DNA 沟槽 -23.94 -0.50 -39.81 G16, C9和C8

表4 DNA和乌头碱的分子对接参数 Table 4 The molecular simulation results of Aconitine-DNA System

将2.2.2和2.2.3实验结论对照图6、 表4的分子计算结果, 发现模拟计算获得反应的结合能与实验测定所得的Δ G接近, 同时, 依据实验数据判定的作用力类型在分子模拟中得到印证, 即理论计算与实验基本吻合。