引用本文
李想, 谭丽丽, 刘吉成, 李莉, 贾首时. TLC原位拉曼光谱法快速检测减肥类保健食品中非法添加的四种成分[J]. 光谱学与光谱分析, 2018,38(3): 830-836.
LI Xiang, TAN Li-li, LIU Ji-cheng, LI Li, JIA Shou-shi. Rapid Detection of Four Chemical Components Added Illegally in Slimming Health Food with TLC Situ Raman Spectroscopy[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2018,38(3): 830-836.
Doi:10.3964/j.issn.1000-0593(2018)03-0830-07  
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TLC原位拉曼光谱法快速检测减肥类保健食品中非法添加的四种成分
李想1, 谭丽丽1, 刘吉成1, 李莉1,*, 贾首时2
1. 齐齐哈尔医学院药学院, 黑龙江 齐齐哈尔 161006
2. 齐齐哈尔市食品药品检验检测中心, 黑龙江 齐齐哈尔 161006
*通讯联系人 e-mail: lilianlinsuo@163.com

作者简介: 李想, 1988年生, 齐齐哈尔医学院药学院科研助理 e-mail: muxiang6199468@163.com

收稿日期: 2016-10-27
基金: 国家自然科学基金项目(81573660), 黑龙江省齐齐哈尔市科学技术计划项目(SFGG-201541), 齐齐哈尔医学院自选科研基金项目(QY2016Z-22)资助
摘要

建立薄层色谱(TLC)与拉曼光谱联用方法, 并对减肥类保健食品中非法添加的四种化学成分(茶碱、 咖啡因、 苯丙酸诺龙、 螺内酯)进行检测。 采用TLC法将掺杂成分与保健食品基质进行初步分离, 在紫外灯(254 nm)下检视定位, 以780 nm激光为光源, 对TLC上微量掺杂成分的斑点原位, 直接检测浓集点的拉曼光谱。 考察不同配方保健食品基质对掺杂成分拉曼光谱的影响, 并对检测限进行验证, 初步建立了减肥类保健食品中四种掺杂成分的TLC原位拉曼光谱检测方法。 常用保健食品基质对掺杂成分检测结果无干扰, 检测限为2~4 μg, 在九种减肥类保健食品中检测出两种含有咖啡因。 该研究建立了TLC与拉曼光谱联用技术并采用此方法快速鉴别了减肥保健食品中茶碱等四种非法添加化学成分, 本法专属、 灵敏、 快速、 简便, 可为保健食品中非法添加化学成分的快速检测技术研究提供新的参考依据。

关键词: 薄层色谱; 原位拉曼光谱; 原位浓集; 减肥类保健食品; 非法添加
中图分类号:O657.3 文献标志码:A
Rapid Detection of Four Chemical Components Added Illegally in Slimming Health Food with TLC Situ Raman Spectroscopy
LI Xiang1, TAN Li-li1, LIU Ji-cheng1, LI Li1,*, JIA Shou-shi2
1. Qiqihar Medical University College of Pharmacy, Qiqihar 161006, China
2. Qiqihar Food and Drug Inspection and Testing Center, Qiqihar 161006, China
Abstract

To establish a thin layer chromatography (TLC) combined with Raman spectroscopy method and detect four chemical components (theophylline, caffeine, nandrolone phenylpropionate, spironolactone) added illegally in the slimming health food. The doping ingredient and substrate were separated with TLC, viewed and located with UV light (254 nm), the spot of the doping ingredient is concentrated on the TLC plate before detecting the Raman spectroscopy of the concentrated point directly with 780 nm laser source. The effects of different formulations of slimming health food were studied, the limit of detect ( LOD) was validated, and the TLC Situ Raman Spectroscopy method was established initially for detecting four chemical components added in the slimming health food. The common substrate in the slimming health food had no interference with the detecting results of doping components. The LOD was 2~4 μg. Two out of nine kinds of health food were detected to be with caffeine. In this study, we established TLC and Raman spectroscopy for the first time which was used for quick identification of four kinds of illegal chemicals added in health food, such as theophylline, etc. The method is precise, sensitive, rapid and simple, which could provide a new reference for the technology research of rapid detection of the ingredients added illegally in health food.

Keyword: TLC; Raman spectroscopy in situ; Concentration in situ; Slimming health food; Added illegally
引言

随着人们生活水平的提高, 追求“ 以瘦为美” 的女性越来越多, 故对减肥类保健食品的需求量日益增加。 因保健食品价格昂贵, 一些不法商贩肆意向减肥类保健食品中非法添加一些化学药物[1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8], 使消费者以脱水、 腹泻、 抑郁、 内分泌紊乱等严重伤害机体健康的“ 自残行为” 为代价, 达到“ 减肥” 的假象[9], 进而牟取暴利。 因此, 建立一种快速检测减肥类保健食品中非法添加物质的方法, 对防范此类不法行为具有重要意义。

现有保健食品掺杂成分的检测方法较多, 一类是采用操作简便的色谱技术如TLC法、 HPLC法[1, 2, 3, 4], 专属性较低, 光谱技术如拉曼光谱法[5, 12]等, 拉曼光谱是一种与入射光频率不同的散射光谱, 它能反应不同物质分子振动、 转动的结构信息, 专属性较高, 但其灵敏度较低。 表面增强拉曼光谱(SERS)可提高其检测的灵敏度, 但对待测成分结构的选择性较高[14]。 虽有一些采用TLC-SERS法检测保健食品中掺杂成分的报道[15], 但仍有许多掺杂成分SERS信号较弱, 甚至无SERS信号。 另一类是采用专属性较高的联用技术, 如TLC-IR法[13]、 LC-MS法[11]等, 但预处理繁琐、 检验周期长、 成本高。 故将上述方法用于快速检测均存在一些局限性。

伴随显微拉曼成像光谱技术的发展, 实现了微量成分在显示器上的可视化检测[16], 使拉曼光谱的应用更加灵活与广泛。 本项研究采用薄层色谱(TLC)初步分离减肥类保健食品的掺杂成分, 并原位浓集色谱斑点, 提高待测微量成分的密度, 通过可视化图像直接测定高密度点成分的拉曼光谱, 建立了减肥类保健食品中非法添加的茶碱、 咖啡因、 苯丙酸诺龙、 螺内酯四种化学成分的TLC原位拉曼光谱检测方法。 该方法专属、 灵敏、 快速、 简便, 可为保健食品中非法添加化学成分检测技术的研究提供新的参考依据。

1 实验部分
1.1 试剂与仪器

茶碱(A, 批号: 100121-201104)、 咖啡因(B, 批号: 171215-200305)、 苯丙酸诺龙(C, 批号: 004-8102)、 螺内酯(D, 批号: 0193-9601)对照品均购自中国食品药品检定研究院; 硅胶GF254铝制薄层板(Merck公司); 甲醇、 三氯甲烷、 丙酮、 冰醋酸、 氨水、 氢氧化钠、 乙醇均为分析纯; 实验用水为纯净水; 九批减肥类保健食品均为市售品。

DXRxi显微拉曼成像光谱仪(激光波长780 nm, Thermo Fisher Scientific, USA); XS105 DualRange 分析天平(精度为0.01 mg, METTLER TOLEDO, Switzerland); UP50超声波清洗器(南京垒君达超声电子设备有限公司); WFH-203B型三用紫外分析仪(上海精科实业有限公司); 定量毛细管(2 μ L)、 层析缸(10 cm× 10 cm, 20 cm× 20 cm)均为市售品。

1.2 溶液制备

1.2.1 对照品溶液的制备

分别取A, B, C和D对照品适量, 精密称定, 加入乙醇5 mL, 使其溶解, 制成浓度依次为4, 3, 5和2 mg· mL-1的溶液, 备用。

1.2.2 模拟阳性样品Ⅰ 溶液的制备

取一次服用剂量的某配方减肥类保健食品的胶囊内容物(经齐齐哈尔市食品药品检验检测中心测定不含A, B, C和D, 可作为阴性样品), 研细, 精密称取对照品(A)适量加入其中, 作为模拟阳性样品Ⅰ , 加入10 mL乙醇, 摇匀, 超声10 min, 微孔滤膜过滤, 再用2 mL乙醇洗涤残渣与滤膜, 合并滤液与洗涤液, 浓缩至5 mL, 使A的含量与对照品(A)溶液一致, 备用。

1.2.3 模拟阳性样品Ⅱ 溶液的制备

分别精密称取三种对照品(B, C和D)适量, 加入阴性样品中, 作为模拟阳性样品Ⅱ , 其他操作同“ 模拟阳性样品Ⅰ 溶液的制备” 。

1.2.4 真实样品溶液的制备

取一次服用剂量的样品, 研细, 加入10 mL乙醇, 摇匀, 超声10 min, 微孔滤膜过滤, 再用2 mL乙醇洗涤残渣与滤膜, 合并滤液与洗涤液, 浓缩至5 mL, 备用。

1.3 方法

1.3.1 茶碱的检测方法

分别吸取对照品(A)溶液和样品溶液2 μ L, 点于同一硅胶GF254薄层板上, 以氯仿-甲醇-丙酮-冰醋酸(9: 2: 1: 0.5)为展开剂, 展开, 取出, 晾干, 置紫外灯(254 nm)下检视定位, 分别在对照品(A)及相同Rf的阳性样品斑点处, 用乙醇原位浓集待测成分, 直接检测浓集点的拉曼光谱。

拉曼光谱采集条件: 780 nm激光光源, 显微镜倍数为10倍, 图像像素为100.0 μ m, 扫描范围为100~3 300 cm-1, 50 μ m共聚焦针孔光阑, 扫描方式为区域面扫, 激光功率为24.0 mW, 曝光时间为0.2 s, 扫描次数为20。 实验所得光谱图均未经过平滑处理, 数据采集及分析软件为OMNICxi, 制图软件为OriginPro 8。

1.3.2 咖啡因、 苯丙酸诺龙、 螺内酯的检测方法

分别取三种对照品(B, C, D)溶液和样品溶液6 μ L, 以乙酸乙酯-丙酮-氨水(5: 1: 0.06)为展开剂, 其他操作同1.3.1。

2 结果与讨论
2.1 TLC展开系统的选择

本实验中茶碱的TLC条件参考了文献[17]方法, 最终确定采用的是氯仿-甲醇-丙酮-冰醋酸(9: 2: 1: 0.5)作为展开剂。 对于咖啡因、 苯丙酸诺龙及螺内酯检测方法中TLC展开剂的确定, 考察了三氯甲烷-甲醇-氨水(11: 1: 0.12)和乙酸乙酯-丙酮-氨水(5: 1: 0.06)两种系统的展开效果, 结果无明显差异。 由于三氯甲烷毒性较大, 最终采用了乙酸乙酯-丙酮-氨水(5: 1: 0.06)作为展开剂。

2.2 对照品粉末拉曼光谱与TLC原位拉曼光谱

按照“ 1.3” 操作, 分别测定了A, B, C和D四种对照品纯固体的拉曼光谱及点样沉积量32 μ g的TLC原位显微拉曼光谱, 见图1。

图1 四种(A, B, C, D)对照品粉末拉曼光谱及TLC原位拉曼光谱
a: 粉末拉曼光谱图; b: TLC原位拉曼光谱图Fig.1 The Raman spectra of powder and TLC in situ of reference substance (A, B, C, D)
a: Raman spectra of powder; b: Raman spectra of TLC in situ

由图1可见, A, B, C和D的TLC原位拉曼光谱与相应纯固体的拉曼光谱一致, 但不同对照品拉曼光谱的峰高、 峰位及峰形均有明显差异, 其特征峰及归属见表1, 说明拉曼光谱可反映不同化合物结构的指纹信息, 专属性很强。

表1 对照品拉曼光谱特征峰及归属 Table 1 The characteristic peaks and belonging of Raman spectrum of reference substance
2.3 专属性考察

2.3.1 减肥类保健食品体系的分析

保健食品体系复杂, 通过对九种减肥类保健食品的配方分析, 可知常见成分有左旋肉碱(可促使脂肪转化为能量的类氨基酸)、 茶多酚(具有降脂助消化的茶叶中多酚类物质的总称)、 决明子(具有利尿作用的中药材)、 荷叶(具有减肥降脂作用的中药材)等, 见表2。

表2 九种减肥类保健食品的主要成分 Table 2 The main ingredients of 9 kinds of slimming health food

由此可见, 在检测减肥类保健食品掺杂成分时, 不仅要考虑左旋肉碱、 茶多酚等化学成分的干扰, 更要关注决明子、 荷叶等中药材或提取物中各种微量成分的影响。

2.3.2 模拟阳性样品检测

本研究通过表2中九种配方保健食品的模拟阳性样品及阴性样品, 分别对四种掺杂成分检测方法的专属性进行了研究。 结果表明, 这些保健食品基质对添加的A, B, C, D检测结果几乎无干扰。 现仅以基质为中药材的样品1为例, 按照“ 1.3” 操作, 分别对相应的模拟阳性样品与阴性样品检测, 结果见图2与图3。

图2 TLC结果(a)及原位拉曼光谱(b)
R′A: A的显微拉曼像图; RA: A对照品; +: 模拟阳性样品; -: 阴性样品Fig.2 The TLC result of A (a) and Raman spectrum of TLC in situ (b)
R′A: Micro-Raman imaging map; RA: Reference substance; +: Simulated positive sample Ⅰ ; -: Negative sample

图3 对照品B, C, D的TLC结果(a)及TLC原位拉曼光谱(b)
RB, RC, RD: 对照品B, C, D; RB, C, D: B, C, D混合对照品; +: 模拟阳性样品Ⅱ ; -: 阴性样品Fig.3 The TLC result of B, C, D (a) and Raman spectra of TLC in situ (b)
RB, RC, RD: B, C, D reference substance; RB, C, D: Mixture of B, C, D reference substance; +: Simulated positive sample Ⅱ ; -: Negative sample

从图2(a)可见, 在TLC中与对照品(A)Rf相同的位置, 阳性样品Ⅰ 有斑点、 阴性样品无斑点, 说明茶碱(A)与保健食品基质能初步分离。 为进一步提高保健食品中A的检测专属性, 分别检测TLC中对照品(A)、 与其Rf相同处模拟阳性样品及阴性样品的拉曼光谱, 从图2(b)可见, 对照品(A)与阳性样品的拉曼光谱一致, 而阴性样品无拉曼信号, 说明本法对A的检测具有较高的专属性。

从图3(a)可见, 阳性样品Ⅱ 的TLC带中, 与对照品(B, C, D)斑点Rf相同处均有斑点, B(咖啡因)、 C(苯丙酸诺龙)、 D(螺内酯)的Rf分别为0.41, 0.86, 0.80, 且与基质中多数成分初步分离; 阴性样品色谱带中, 在与对照品(B)Rf相同处无斑点, 但与对照品(C, D)的Rf相近处均有斑点, 说明C, D与样品基质未达到分离。 从图3(b)可见, 三种对照品(B, C, D)与Rf相同的阳性样品斑点的拉曼光谱均一致, 而阴性样品在此Rf处均无拉曼信号, 说明本法不仅对B(能与基质初步分离)的检测具有较高的专属性, 而且对C和D(不能与基质初步分离)两种成分的检测, 也具有良好的专属性。

2.4 检测限考察

按1.3节操作, 将四种对照品(A, B, C和D)溶液均稀释成2 mg· mL-1的溶液, 再分别取不同体积点于同一薄层板上, 使各成分的点样沉积量为1~12 μ g, 分别检测相应的拉曼光谱, 结果见图4。 四种对照品不同点样沉积量拉曼光谱基峰(A, 552 cm-1, B, 552 cm-1, C, 1 000 cm-1, D, 1 620 cm-1)的强度分析见图5, 由图4和图5可见, 随着点样沉积量的增加, 各对照品拉曼光谱峰强度逐渐增加。 根据信噪比(S/N)等于3时所对应的点样沉积量可知, A, B, C和D的LOD分别为4, 4, 4和2 μ g, 已明显低于保健食品中可能的掺杂量, 见表3。

图4 A, B, C, D四种对照品TLC不同点样沉积量的拉曼光谱图
R: 对照品Fig.4 The Raman spectra of different deposition amount of reference substance (A, B, C, D)
R: Reference substance

图5 对照品不同点样沉积量拉曼光谱基峰的强度分析Fig.5 Strength analysis of the base peak of the Raman spectra of different deposition amount of reference substance

表3 减肥类保健食品中四种化学成分的可能掺杂量 Table 3 The possible addition amount of four kinds of chemical composition in slimming health food
2.5 真实样品检测

分别吸取对照品(A, B, C和D)溶液及九种保健食品的样品溶液6 μ L, 按照1.3节操作, 由图6的TLC结果可见, 在与对照品(A, C和D)斑点Rf相同处, 九种样品均无斑点, 可能不含茶碱、 苯丙酸诺龙与螺内酯; 在与对照品(B)Rf相同处有斑点的分别为样品5, 6, 7, 8, 9号, 且样品8和9斑点颜色较深, 可能含咖啡因。 因保健食品体系复杂, 因此, 仅凭Rf不足以确定样品中是否含有相应的对照品。

图6 九种减肥类保健食品的TLC结果
(a): 茶碱(A)的检测; (b): 咖啡因(B)、 苯丙酸诺龙(C)与螺内酯(D)的检测Fig.6 The TLC results of 9 kinds of slimming health food
(a): Detection of Theophylline (A); (b): Detection of Caffeine (B), Nandrolone Phenylpropionate (C), Spironolactone (D)

采集所有样品色谱带中与对照品(A, B, C, D)相应位置的拉曼光谱, 并与相应对照品色谱斑点的拉曼光谱比较。 结果显示, 样品8和9与对照品(B)的拉曼光谱峰形、 峰位、 峰强几乎完全一致, 见图7, 说明样品8和9一次服用剂量中含有咖啡因的量与5 mL对照品溶液中的量相当, 已达到药物制剂最小用量或保健食品中可能的掺杂量(见表3), 若长期服用, 可能对身体产生不良作用。

图7 样品8、 9的拉曼光谱
RB: B对照品; S8: 样品8; S9: 样品9Fig.7 The Raman spectra results of sample 8 and 9
RB: B reference substance; S8: Sample 8; S9: Sample 9

茶多酚是许多减肥类保健食品中常见的成分(见表2), 是从茶叶中提取出的一种具有助消化、 降血脂、 降血压、 降血糖等作用的多酚类化合物, 主要包括儿茶素类、 黄酮类、 花色素类、 酚酸及缩酚类等物质, 其中儿茶素含量约占总量约60%~90%。 咖啡因是茶叶中含量最高且具有较强中枢兴奋作用的物质, 因此在茶多酚提取制备过程中, 咖啡因作为杂质需尽量去除[18]。 本实验所检出的样品8和9中的咖啡因, 可能是相应保健食品中所含茶多酚的杂质(咖啡因)超限所致。

3 结论

本项研究建立了TLC与拉曼光谱联用方法, 并用于减肥类保健食品中四种非法添加成分(茶碱、 咖啡因、 苯丙酸诺龙、 螺内酯)的检测, 结果在九种市售样品中检出两种样品中含有咖啡因。 该方法专属、 灵敏、 快速、 简便, 可为保健品中掺杂成分快速检测方法的研究提供新的参考依据。

The authors have declared that no competing interests exist.

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