引用本文
徐蓓蕾, 孙素琴, 张贵君, 李文兰, 王锐, 张琰, 金哲雄, 松林. 处方应用三种葛根水煎液的二维相关红外光谱分析[J]. 光谱学与光谱分析, 2018,38(3): 800-804.
XU Bei-lei, SUN Su-qin, ZHANG Gui-jun, LI Wen-lan, WANG Rui, ZHANG Yan, JIN Zhe-xiong, SONG Lin. Study on Aqueous Extracts of Three Kinds of Radix Puerariae in Clinical by 2D-IR Correlation Spectroscopy[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2018,38(3): 800-804.
Doi:10.3964/j.issn.1000-0593(2018)03-0800-05  
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处方应用三种葛根水煎液的二维相关红外光谱分析
徐蓓蕾1, 孙素琴2, 张贵君3, 李文兰1, 王锐4, 张琰1, 金哲雄1,*, 松林5
1. 哈尔滨商业大学药学院, 黑龙江 哈尔滨 150076
2. 清华大学化学系, 北京 100084
3. 北京中医药大学中药学院, 北京 100102
4. 哈尔滨市口腔医院综合科, 黑龙江 哈尔滨 150002
5. 内蒙古医科大学蒙医药学院, 内蒙古 呼和浩特 010059
*通讯联系人 e-mail: zhexiongjin@163.com

作者简介: 徐蓓蕾, 女, 1983年生, 哈尔滨商业大学药学院讲师 e-mail: xubeilei2006@163.com

收稿日期: 2017-06-07
基金: 黑龙江省博士后基金项目(LBH-ZH13121), 哈尔滨商业大学科研启动基金项目(13DL024), 哈尔滨市应用技术研究与开发项目(2016RAQXJ009), 国家自然科学基金地区基金项目(81360677)资助
摘要

中药是复杂的化学体系, 建立快速、有效的分析方法有助于中药水煎液的实时质量控制。 葛根在处方中常用有三种, 分别为粉葛、野葛和煨葛(葛根炮制品), 且传统应用中多采用水煎煮的方式, 因此, 采用傅里叶变换红外光谱技术(FTIR), 二阶导数光谱(SD-IR), 结合二维相关红外光谱(2D-IR)对三种葛根水煎液进行快速分析。 结果表明, 通过FTIR和SD-IR光谱能够将粉葛水煎液明显区别于野葛和煨葛水煎液。 经过2D-IR分析, 发现野葛经过煨制后水煎液化学成分发生了变化, 二者在主要的自动峰和交叉峰的位置和强度方面存在较大差异, 在1 800~1 300 cm-1范围内, 野葛水煎液中最强的自动峰为1 556 cm-1, 次强峰为1 561 cm-1, 而在煨葛水煎液中最强自动峰为1 563 cm-1, 次强为1 572 cm-1, 再次为1 556 cm-1。 另外, 在野葛水煎液中出现了明显的1 536和1 634 cm-1自动峰, 二者的强度相当。 野葛及煨葛水煎液的2D-IR光谱中, 出现的自动峰1 448和1 518 cm-1的相对强度有较大的差异。 在野葛水煎液的2D-IR光谱中, 交叉峰(1 518, 1 561)和(1 518, 1 563) cm-1强于煨葛水煎液中相应峰。 凭借2D-IR自动峰和交叉峰可以较直观地鉴别野葛和煨葛水煎液, 并揭示二者相应各官能团的变化规律, 能够为葛根在临床处方应用过程中, 水煎液的快速质量控制提供依据。 利用FTIR, SD-IR结合2D-IR的整体性和宏观指纹性, 可以为中药等复杂体系的逐级鉴别提供快速、准确的方法和手段。

关键词: 傅里叶变换红外光谱; 二阶导数光谱; 二维相关红外光谱; 葛根水煎液
中图分类号:O657.3 文献标志码:A
Study on Aqueous Extracts of Three Kinds of Radix Puerariae in Clinical by 2D-IR Correlation Spectroscopy
XU Bei-lei1, SUN Su-qin2, ZHANG Gui-jun3, LI Wen-lan1, WANG Rui4, ZHANG Yan1, JIN Zhe-xiong1,*, SONG Lin5
1. School of Pharmacy, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China
2. Department of Chemistry, Tsinghua University, Beijing 100084, China
3. College of Pharmaceutics, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China
4. Integrated Department, Harbin Stomatological Hospital, Harbin 150002, Chinal5. College of Mongolian Medicine, Inner Mongolia Medical University, Huhhot 010059, China
Abstract

Traditional Chinese medicine is a complicated chemical mixture system. It is helpful for quality control of traditional Chinese medicine to establish a fast and effective analysis method. There are three kinds of Radix Puerariae in clinical, which are Pueraria thomsonii Benth, Pueraria lobata (Willd. ) Ohwi and simmered Pueraria lobata (Willd.) Ohwi (processed Radix Puerariae). Furthermore, aqueous extract is an important method for Radix Puerariae in clinical application. Therefore, a macroscopic IR fingerprint method, conventional Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) combined with second derivative infrared spectroscopy (SD-IR) and two-dimensional correlation infrared spectroscopy (2D-IR), was applied to quickly analyze aqueous extracts of three kinds of Radix Puerariae in this study. The results showed that aqueous extract of Pueraria thomsonii Benth was different from aqueous extracts of Pueraria lobata (Willd.) Ohwi and simmered Pueraria lobata (Willd.) Ohwi by FTIR and SD-IR. There were differences of Pueraria lobata (Willd.) Ohwi after simmered by 2D-IR analysis. There were distinctive differences of main auto-peaks and cross-peaks in position and intensity. In the range of 1 800~1 300 cm-1, the strongest auto-peak was at 1 556 cm-1, and the second one appeared at 1 561 cm-1 in 2D-IR spectra of aqueous extracts of Pueraria lobata (Willd.) Ohwi. However, the strongest auto-peak was at 1 563 cm-1, and the second one appeared at 1 572 cm-1 in 2D-IR spectra of aqueous extracts of simmered Pueraria lobata (Willd.) Ohwi. In addition, there were two obvious auto-peaks at 1 536 and 1 634 cm-1, whose intensities were equal in 2D-IR spectra of aqueous extracts of Pueraria lobata (Willd.) Ohwi. The relative intensities of auto-peaks at 1 448 and 1 518 cm-1 were different in the two 2D-IR spectra. The cross-peaks at (1 518, 1 561) cm-1 and (1 518, 1 563) cm-1 of aqueous extract of Pueraria lobata (Willd.) Ohwi were stronger than those in 2D-IR of aqueous extract of simmered Pueraria lobata (Willd.) Ohwi. Therefore, aqueous extracts of Pueraria lobata (Willd.) Ohwi and simmered Pueraria lobata (Willd.) Ohwi can be identified intuitively by auto-peaks and cross peaks in 2D-IR spectra, and the change laws of functional groups of them can be revealed. It can provide the basis for the fast quality control of Radix Puerariae decoction in the process of clinical prescription application. The method including FTIR, SD-IR and 2D-IR, is rapid and exact, and can provide the means to analyze the complicated chemical mixture systems step by step.

Keyword: FTIR spectroscopy; SD-IR spectroscopy; 2D-IR correlation spectroscopy; Aqueous extracts Radix Puerariae
引言

1977年— 2000年药典记载, 葛根的来源为豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.)Ohwi和甘葛藤Puerarin thomsonii Benth.的干燥根。 2005年— 2015年版药典直接将粉葛Puerariae Thomsonii Radix另立, 其来源依旧为豆科植物甘葛藤Puerarin thomsonii Benth.的干燥根; 而葛根Puerariae Lobatae Radix的来源仅为豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.)Ohwi[1]。 葛根在临床处方中主要有三种应用形式, 除上述所提到野葛、粉葛外, 还有野葛的炮制品— — 煨葛。 中药品种复杂, 相同中药不同品种之间, 以及相同品种的不同炮制品之间, 功效及药效成分均存在差异。 野葛发汗退热的作用强于粉葛, 粉葛的生津止渴作用强于野葛, 煨葛止泻作用强于前两种。 葛根在传统的临床应用中多采用水煎煮的方式, 因此, 有必要对葛根的水煎液进行质量控制。 常用于葛根有效成分分析的方法有高效液相色谱, 高效薄层色谱和傅里叶变换近红外光谱(HPLC, HPTLC和FTNIR)等。 上述方法可以提供具体化学成分的含量信息, 但也有一定的局限性, 包括实验仪器昂贵, 检测时间长, 对照品与溶剂的消耗量大, 一种溶剂系统和检测器往往只能够对某一类成分进行测定等[2]。

傅里叶变换红外光谱技术(FTIR)、二阶导数光谱(SD-IR), 结合二维相关红外光谱(2D-IR)实现了红外光谱的三级鉴定, 且具有取样量小, 快速、无损的特点与超强的宏观指纹性, 特别适合中药等复杂体系的分析, 可以在应用色谱之前首先发挥重要的先导作用, 是中药质控的必要手段。 清华大学孙素琴教授课题组在此方面做了大量的工作, 如利用FTIR结合2D-IR的宏观指纹鉴别方法, 对中药的品种(植物药、动物药)进行鉴别, 其中也包括对不同采收期、不同产地、不同入药部位中药的鉴别; 对中药炮制及提取进行质量控制; 对中成药的生产过程进行质量控制[2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11]。 本文采用FTIR结合2D-IR的方法研究三种葛根水煎液成分差异, 对于葛根处方在临床应用过程中的质量控制具有重要的意义。

1 实验部分
1.1 仪器设备

Spectrum GX 型傅里叶变换红外光谱仪(美国Perkin Elmer公司); DTGS检测器(光谱范围为4 000~400 cm-1, 分辨率4 cm-1, 扫描信号累加次数为32次, 扫描时扣除了水和二氧化碳的干扰); 变温附件为Portable Controller 可编程控制单元(50-886 型), 控温范围50~120 ℃(Love Control公司); FD-1型冷冻干燥机(北京博医康技术公司); KDM型调温电热套(山东鄄城华鲁电热仪器有限公司)等。

1.2 样品处理

葛根(野葛, 煨葛, 粉葛)(野葛来自湖南, 煨葛为其炮制品; 粉葛来自广西)以上饮片均购买自河北安国祈新饮片厂, 经张贵君教授鉴定均为正品。 对照品: 葛根素(中国药品生物制品检定所提供, 批号110752-200511)。

采用传统水煎煮的方法, 分别煎煮各种饮片。 首先将各饮片8 g, 分别浸泡于10倍量水中30 min后, 进行煎煮。 水沸后煎煮30 min, 滤过, 残渣加10倍量的水, 水沸后再煎30 min, 趁热过滤; 合并两次滤液, 浓缩, 冷却至常温后, 加水调整到相对药材浓度0.1 g· mL-1。 于-20 ℃预冻不少于24 h, 而后置于冷冻干燥机, 冷冻干燥, 获得样品。

1.3 测定与数据处理

将实验样品与KBr混合, 研磨均匀后压片, 进行红外光谱检测, 13点平滑, 获得红外光谱图。 二阶导数谱是取原始谱图各点的二阶导数, 采用Savitzky Golaypolynomial拟合方法对其进行测定。 通过程序控制升温(样品池持续升温2 ℃· min-1), 从50~120 ℃, 每隔10 ℃进行原位实时扫描红外谱图— — 变温动态谱, 利用二维相关分析软件计算这些动态光谱, 即获得二维红外相关光谱。

2 结果与讨论
2.1 三种葛根水煎液FTIR光谱的分析

图1为三种葛根水煎液和主要成分葛根素标准品的红外光谱图。 表1为葛根素的红外光谱谱峰归属, 1 633, 1 515, 1 447, 1 396, 893, 836和797 cm-1等, 主要来源于 νC＝0, ν Ar, δ C— H和 νC—H[2]。 在野葛和煨葛的水煎液的FTIR图谱中均能找到葛根素相应的特征峰, 主要由葛根素特征峰在葛根水煎液整体谱图中表现的峰强与峰形所决定, 分别对应1 626, 1 515, 1 443, 1 400, 888, 837和797 cm-1, 1 623, 1 515, 1 443, 1 400, 889, 836和796 cm-1, 野葛和煨葛水煎液图谱中葛根素的特征峰并无明显差异, 最大仅差3个波数。 而在粉葛水煎液的FTIR谱图中除1 635 cm-1明显外, 其余来源于葛根素的峰均不明显, 说明野葛和煨葛水煎液中葛根素含量较粉葛水煎液高, 也进一步说明粉葛水煎液与煨葛和野葛水煎液的化学成分有明显差异。 另外, 在粉葛水煎液的FTIR图谱中, 1 155, 1 079和1 019 cm-1三个峰明显, 主要来源于淀粉的特征峰, 说明在经过水煎煮后, 粉葛水煎液中依然含有大量淀粉成分。 除了来源于葛根素的光谱峰, 还有一个明显1 730 cm-1左右的峰, 来源于葛酚苷类化合物的芳香内酯结构的, νC＝0[2]该峰在粉葛水煎液中较明显, 出现在1 731 cm-1, 在煨葛水煎液中, 该峰出现在1 727 cm-1, 较粉葛水煎液中移动了4 cm-1, 而该峰在野葛水煎液FTIR光谱中并不明显, 说明野葛与煨葛水煎液中葛酚苷类成分含量存在一定差异[2]。

图1 三种葛根水煎液FTIR光谱的比较
a: 粉葛; b: 野葛; c: 煨葛; d: 葛根素Fig.1 Comparison of FTIR spectra of three kinds of Radix Puerariae decoction
a: Pueraria thomsonii Benth; b: Pueraria lobata (Willd.) Ohwi; c: Simmered Pueraria lobata (Willd.) Ohwi; d: Puerarin

表1 三种葛根水煎液的FTIR分析 Table 1 FTIR spectra of three kinds of Radix Puerariae decoction
2.2 三种葛根水煎液SD-IR光谱的分析

图2为三种葛根水煎液的SD-IR光谱图, 在1 800~1 300 cm-1范围内, 可以明显看出粉葛水煎液与野葛、 煨葛水煎液之间的差别, 如较强较宽的1 730 cm-1, 而该峰在煨葛水煎液的SD-IR光谱中则相对于粉葛水煎液1 730 cm-1的峰较弱, 在野葛水煎液中极不明显, 进一步证明了其中葛酚苷类化学成分含量存在较大差别。 粉葛水煎液中1 518 cm-1的峰强也与野葛、 煨葛水煎液中1 515 cm-1存在极大的差异, 且相差3 cm-1。 另外, 在粉葛水煎液SD-IR光谱中1 679, 1 627, 1 463和1 415 cm-1等峰也与另外两种葛根水煎液SD-IR光谱中相应峰有较大的差别。 对比野葛、煨葛水煎液, 可以发现二者除在1 730 cm-1处存在明显差别外, 在1 632, 1 543(1 544), 1 445, 1 396(1 399) cm-1等处的峰形、峰强亦存在差异, 同时煨葛水煎液较野葛水煎液在1 399 cm-1处发生红移, 上述峰依次对应葛根素的1 633, 1 545, 1 445和1 397 cm-1等特征峰; 在900~750 cm-1内, 粉葛水煎液与另两种葛根水煎液存在较大差异。 而野葛水煎液836和820 cm-1峰与煨葛水煎液839和820 cm-1峰, 除在峰形上存在一定差异, 二者在相应峰的波数上相差并不大, 最大仅差1 cm-1。

图2 三种葛根水煎液SD-IR光谱的比较
a: 粉葛; b: 野葛; c: 煨葛; d: 葛根素Fig.2 Comparison of SD-IR spectra of three kinds of Radix Puerariae decoction
a: Pueraria thomsonii Benth; b: Pueraria lobata (Willd.) Ohwi; c: Simmered Pueraria lobata (Willd.) Ohwi; d: Puerarin

2.3 野葛、煨葛水煎液2D-IR光谱的比较分析

图3为野葛、煨葛水煎液的2D-IR光谱图, 能够显示出一维图谱所不能提供的信息。 实验结果显示, 二者在主要的自动峰和交叉峰的位置和强度方面均存在较大差异。 野葛水煎液2D-IR光谱图中最强的自动峰为1 556 cm-1, 次强峰为1 561 cm-1, 而在煨葛水煎液2D-IR光谱图中最强自动峰为1 563 cm-1, 次强为1 572 cm-1, 再次为1 556 cm-1。 另外, 在野葛水煎液中出现了明显的1 536和1 634 cm-1自动峰, 二者的强度相当。 野葛及煨葛水煎液的2D-IR光谱中, 出现的自动峰1 448和1 518 cm-1的相对强度有较大的差异。 交叉峰(1 518, 1 561)和(1 518, 1 563) cm-1强于煨葛水煎液中相应峰。 上述这些峰主要来自于葛根素等异黄酮类成分的环伸缩振动。 除以上差别外, 自动峰1 700 cm-1在煨葛水煎液中出现, 这一点与野葛水煎液不同, 进一步说明野葛、煨葛水煎液中化学成分存在明显的差异, 经炮制发生了本质的变化[2, 3]。

图3 两种葛根水煎液2D-IR光谱的比较
(a): 野葛; (b): 煨葛Fig.3 Comparison of SD-IR spectra of two kinds of Radix Puerariae decoction
(a): Pueraria thomsonii Benth; (b): Pueraria lobata (Willd.) Ohwi

3 结论

红外光谱技术具有快速、无损、整体性及宏观指纹性的特点, 可提供丰富的化学成分信息。 正是由于其宏观指纹性的特点, FTIR结合2D-IR技术特别适合于对中药等复杂体系进行逐级鉴定与分析。 研究表明, 利用FTIR, SD-IR能够将粉葛水煎液成功区分, 但野葛和煨葛水煎液的一维图谱较相似, 除了1 700 cm-1的差异。 利用2D-IR, 可以研究野葛和煨葛水煎液化学成分的差异及热微扰所引起的结构变化, 能够鉴别炮制前后相应各官能团的变化。 该法快速、准确, 为鉴别分析中药化学成分结构变化规律提供了一种新的参考方法[4]。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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