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侯国辉, 陈秉灵, 罗腾, 刘杰, 林子扬, 陈丹妮, 屈军乐. 宽带相干反斯托克斯光谱显微成像技术的实验研究[J]. 光谱学与光谱分析, 2018,38(2): 606-610.
HOU Guo-hui, CHEN Bing-ling, LUO Teng, LIU Jie, LIN Zi-yang, CHEN Dan-ni, QU Jun-le. Experimental Study on Broadband Coherent Anti-Stokes Spectroscopy[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2018,38(2): 606-610.
Doi:10.3964/j.issn.1000-0593(2018)02-0606-05  
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宽带相干反斯托克斯光谱显微成像技术的实验研究
侯国辉, 陈秉灵, 罗腾, 刘杰, 林子扬, 陈丹妮*, 屈军乐*
深圳大学光电工程学院, 光电子器件与系统(教育部/广东省)重点实验室, 广东 深圳 518060
*通讯联系人 e-mail: danny@szu.edu.cn; jlqu@szu.edu.cn

作者简介: 侯国辉, 1985年生, 深圳大学光电工程学院博士研究生 e-mail: houguohui_2008@163.com

收稿日期: 2017-02-03 接受日期: 2017-07-14
基金: 国家重大科学仪器设备开发专项(2012YQ15009203), 国家自然科学基金项目(61235012), 国家重点基础研究发展计划项目(2015CB352005, 2012CB825802)资助
摘要

由于该成像系统采用的超连续谱光源, 可以满足所观测样品本源分子在0~4 000 cm-1内的所有拉曼振动活性模式同时共振增强, 在探测光的作用下, 同时产生宽带相干反斯托克斯拉曼散射信号。 然后, 根据不同的化学键进行光谱图像重构, 可以获得反映不同化学键在样品中的分布的图像。 对110 nm的纯的聚苯乙烯珠所形成的具有一定厚度的薄膜, 通过改变探测激光与超连续谱脉冲之间的时间重合度, 测量形成的相干反斯托克斯拉曼散射信号的时间分布迹线图, 通过其中的1 000 cm-1的化学键强度信号进行指数衰减曲线拟合, 得出具体的退相时间, 与文献中已报道的三色CARS的退相时间相比, 判断是否属于三色CARS。 为了检验系统在实际生物学成像中存在的问题, 我们开展了活体小鼠组织生物学应用成像实验, 对记录的数据在2 940 cm-1的CARS信号进行图像重构, 获得CH化学键在组织中的分布, 然后, 对重构图像直接使用小波变换的去噪方式进行图像去噪, 去噪后的图像具有比较清晰的轮廓, 结果表明, 对于对比度比较强的CARS共振信号, 直接使用小波变换的去噪方式就可以获得比较好的图像效果。 但是, 对于信噪比比较差的共振信号, 使用这种处理方法是不合适的, 需要使用别的方法, 先获取好的信号对比度, 再根据感兴趣的化学键进行图像重构, 然后, 再经过小波变换对图像去噪, 图像不仅会变得清晰平滑, 而且, 具有较好的视觉感官效果。

关键词: 相干反斯托克斯拉曼散射; 拉曼光谱; 小波变换
中图分类号:O657.37 文献标志码:A
Experimental Study on Broadband Coherent Anti-Stokes Spectroscopy
HOU Guo-hui, CHEN Bing-ling, LUO Teng, LIU Jie, LIN Zi-yang, CHEN Dan-ni*, QU Jun-le*
Key Laboratory of Optoelectronic Devices and Systems of Ministry of Education and Guangdong Province, College of Optoelectronic Engineering, Shenzhen University, Shenzhen 518060, China
Abstract

Our imaging system is based on a super-continuum source, which can provide all the samples’ active Raman vibration mode in a range from 0~4 000 cm-1 at the same time. The coming probe pulse interacts with the sample, forming the broadband coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) signal. Then, the image can be reconstructed according to the different chemical bonds, and the distribution of different chemical bonds in the sample can be obtained. In this paper, 110-nm pure polystyrene beads formed a certain thickness of thin films, which can endure high power, by tuning the detection pulse and super-continuum pulse overlay time, measuring the time distribution of the CARS signal and then using exponential decay curve fitting through a chemical bond signal intensity at 1 000 cm-1. This is called the dephasing time. Additionally, it was compared with the CARS dephasing time reported in the literature, and it was determined that it belonged to two-colour or three-colour CARS. To inspect the system application in biological imaging, we carried out the in vivo tissue biology application experiment through recorded data reconstructed in the CARS image at 2 940 cm-1 and the distribution of CH chemical bonds in tissues, and then directly used wavelet transform for image denoising. The denoised image had a clearer outline, and the results showed that the resonant part of the CARS signal contrast was strong and directly using the wavelet transform denoising method can obtain a better image effect. However, the signal-to-noise ratio of the resonant signal was poor, so the use of this approach was not appropriate, and other methods needed to be used to obtain a good signal contrast with the image. Then, according to the interest chemical bond with a good signal contrast to reconstruct image, after the wavelet transform for image denoising, the image will not only become clear and smooth, but have a good vision effect.

Keyword: Coherent anti-stokes Raman scattering; Raman spectroscopy; Wavelet transform

引 言

超快激光技术的发展, 使非线性效应产生的信号强度显著增强, 因此, 基于超快激光器的非线性显微成像技术的研究持续升温。 包括二次谐波[1], 三次谐波[2]显微成像, 双光子荧光[3]、 三光子荧光[4]显微成像及相干反斯托克斯拉曼散射(coherent anti-Stokes Raman scattering, CARS)显微成像。 因为它们都与二阶以上的非线性极化率有关, 所以, 具有较高的空间分辨率。 其中, 双光子荧光及三光子荧光显微成像, 由于样品内部本源分子的荧光量子产额比较低, 所以, 通常采用引入外源荧光探针的方式产生足够强的信号。 而二次谐波、 三次谐波通过样品自身有序排列的结构或者较大的二阶与三阶非线性极化率。 相干反斯托克斯拉曼散射是基于样品自身分子拉曼活性三阶非线性效应进行显微成像的技术, 信号强度主要与分子的拉曼活性强弱有关。 而构成人类的细胞大多数属于有机分子成分, 基本的化学键都是CH, CN, CO, OH, NH键, 它们都具有自身特有的拉曼特征峰。 相干反斯托克斯信号相比于自发拉曼, 信号要强5个数量级以上, 所以, 将相干反斯托克斯拉曼散射应用于生物学显微成像领域具有其得天独厚的优势。

基于分子自身的拉曼振动光谱成像的相干反斯托克斯拉曼散射技术, 由于属于三阶非线性效应, 因此, 具有较高的空间分辨率。 基于本源分子, 相对较强的信号, 较高的空间分辨率是其在显微成像方面得天独厚的优点。 由于CARS过程需要两个同重复频率且不同波长的光脉冲, 同时与样品相互作用, 光源的需求比较高。 所以, 产生了两个分支, 一个是一台激光器同时产生两种不同的光, 技术要求高, 所以造价昂贵; 另一个是通过商用光子晶体光纤产生超连续谱, 从中选出需要的波长, 相对来说, 要容易些, 而本文采用的就是后者。

我们已经通过模拟及四波混频的实验测量方式, 选择了一种商用光子晶体光纤。 其产生的光谱宽度可以与激光共同作用获得0~4 000 cm-1以内的所有拉曼谱。 在解决自由空间耦合与发射稳定性的基础上, 使用获得超连续谱, 利用微位移台移动样品, 采用紧聚焦的前向探测方式进行光谱成像。 这种成像方式, 与单频CARS使用扫描振镜进行光束扫描, 通过光电倍增管的PMT成像方式速度会慢很多。 好处就是可以同时获得焦点激发样品所产生的宽带CARS信号, 通过线阵CCD光谱仪进行测量, 绕开PMT单色仪扫描光谱所花费的时间。

CARS显微成像技术具有高灵敏度与高空间分辨率的同时, 却由于自身属于非线性四波混频过程, 引入了非共振背景。 而非共振背景的存在又会影响成像对比度, 所以, 为了增加成像对比度形成了一些抑制非共振背景信号的手段[5, 6, 7, 8]。 而其中相对比较靠谱, 就是通过共振信号与非共振信号的时间差异进行测量, 这就是时间分辨CARS。 虽然时间分辨CARS可以使实现非共振背景与共振信号完全分离的方式, 但是, 这一技术却依赖于共振信号的振动退向时间大于非共振信号的弛豫时间才能有效的分离。

图1所示, CARS过程, 可以简单地表述为两个阶段, 样品分子激发阶段: 泵浦光ω P与斯托克斯光ω S与物质共同作用, 实现物质激发, 能量存储到分子的化学键中; 诱导提取阶段: 探测光ω P'诱导分子, 将分子中的化学键储能带出, 分子回到基态的同时释放反斯托克斯ω AS信号。

图1 CARS过程能级原理示意图Fig.1 The diagram of CARS process

我们的研究是基于实验室搭建的宽带CARS光谱测量系统, 在紧聚焦的位置引入电动位移样品台移动样品的方式进行点扫描光谱成像。 本文展示了宽带CARS光谱显微成像系统可以同时获得覆盖0~4 000 cm-1以内样品的CARS信号, 一方面给出了定量界定宽带CARS是否属于三色CARS的具体方法, 并在此基础上开展生物学成像实验, 结果表明, 对于信号对比度比较强的拉曼峰, 采用小波去噪的方式去噪后, 效果明显变好, 为即将开展生物学应用(组分分离及定量分析)做铺垫。

1 实验部分

我们搭建的宽带CARS光谱成像实验系统如图2所示。 系统中使用激光器参数: 脉冲宽度120 fs, 中心波长782 nm, 重复频率76 MHz, 平均输出功率1.3 W。 型号: 相干Mira900。 输出的激光首先经过光隔离器, 再由分光平板分成两部分, 一部分经激光过自由空间耦合装置, 耦合进入光子晶体光纤用于产生超连续谱(800~1 200 nm), 另一部分被送入一维电动位移台(使激光与超连续谱脉冲在样品处时间上重合在一起), 在位移台之后, 选择性的插入1 nm的窄带通滤光片。 然后, 激光与超连续谱在合束镜表面合二为一, 共线送入前向紧聚焦CARS光谱成像装置。 在两个前向紧聚焦物镜之间, 采用三维纳米位移台进行样品扫描, 重复精度小于2 nm。 其中, 一维电动位移平台的时间延迟的调节精度达到6.7 fs, 产生的CARS光谱信号, 由QE65pro CCD光谱仪(光谱响应范围200~1 000 nm)探测接收。 产生的CARS信号相比于探测光782 nm而言是蓝移的, 所以, 在信号收集的时候, 在光纤收集透镜之前用截止波长为790 nm的短波通滤光片来消除超连续谱与激光的背景干扰。

图2 双脉冲超连续谱CARS显微成像装置示意图Fig.2 Two-pulse super-continuum CARS Microscopy setup

2 结果与讨论

系统主要采用一对0.75 NA物镜, 通过前向紧聚焦方式的宽带CARS光谱成像, 物镜的工作距离都是0.51 mm。 由于工作距离比较短, 样品都夹在0.17 mm厚的两片盖玻片之间。 聚苯乙烯珠涂在盖玻片上, 然后, 盖上盖玻片, 观察时采用倒扣的放置。

首先通过时间延迟的测量方式对110 nm的聚苯乙烯微球形成的薄膜进行时间分辨的方式测量CARS信号, 其结果如图3所示, 薄膜的好处在于承受功率的强度值比单个110 nm的聚苯乙烯珠高很多, 利于单点长时间相对较高的功率进行光谱测量。

图3 (a)宽带CARS伴随激光延迟; (b)特定时刻t=2.5 ps宽带CARS光谱; (c)1 000 cm-1的振动驰豫时间Fig.3 (a) Broadband CARS with laser pulse delay; (b) Broadband CARS spectrum at relative time t=2.5 ps; (c) Decay time at 1 000 cm-1

因为在1 000 cm-1的聚苯乙烯的拉曼特征峰经过单指数衰减曲线拟合, 具体的公式y=A1exp(-x2/T2)+y0得到的衰减时间T2是1.388 ps, 与已经报道的三色CARS在1.5 ps的退相时间[9]成像结果不一致。 虽然, 从图3(a)的感官上看, 超连续谱分布基本上在一起, 但是, 超连续谱只做斯托克斯光, 激光脉冲既做泵浦光又做斯托克斯光的情形, 属于二色CARS。

此结果说明, 判断是否属于三色CARS最直接的方式, 就是通过时间扫描的方式, 测量已知退相时间的标准样品, 如果时间一致属于三色CARS, 如果小于正常的退相时间属于二色CARS。

我们通过1.01 μ m的聚苯乙烯微球进行CARS成像, 检验编写的成像程序是存在串行数据, 重构后的结果如图4所示。 实验条件是每一个像素的积分时间50 ms, 平均一次, 样品处的总功率9.5 mW, 超连续谱在样品处的功率是2 mW。 我们根据聚苯乙烯材料的明显宽带 CARS在拉曼峰位[10] 1 000, 2 870与3 040 cm-1分别进行图像重构, 对应图中的(a), (b), (c)三个图。

图4 按照不同的中心波数重建的CARS图像
(a) 1 000 cm-1的CARS图像; (b) 2 870 cm-1的CARS图像; (c) 3 040 cm-1的CARS图像; 章(d) 图中相应位置(1.8, 3)的CARS光谱Fig. 4 CARS image reconstruct at different wave number at the center (1.8, 3) of the circle

图4(d)中的光谱曲线对应的图中的圆圈的中心位置, 具体坐标是(1.8, 3)单位是μ m。 图像结果, 说明我们自己编写的控制程序可以正常工作。

在进行生物学成像之前, 对280 nm的聚苯乙烯珠进行光谱成像, 扫描步进是50 nm, 样品处的总功率9.5 mW, 超连续谱2 mW, 光谱积分时间50 ms。 为提高成像对比度, 图像选择2 800~3 100 cm-1积分重构, 结果如图5所示, 对测量值进行高斯曲线拟合得到的半高宽552.9 nm, 通过卷积定理解卷积之后的结果对应的就是当前实验条件下, 实际的系统横向分辨率是476.5 nm。

图5 对280 nm聚苯乙烯珠的CARS成像(a)和测量半高全宽为552.9 nm(b)Fig.5 The CARS imaging of a 280 nm PS bead (a) and its FWHM is 552.9 nm (b)

为了检验成像系统在生物学成像方面还存在什么缺陷, 我们对小鼠的活体肺泡组织进行的宽带CARS光谱成像, 根据2 960 cm-1的C— H键重构的CARS图像如图6(a)所示。 此时, 每个pixel的积分时间是50 ms, 500 nm的采样间隔, 样品处的功率29.5 mW。

图6 小鼠肺泡组织在2 960 cm-1处重建的CARS图像
(a): 去噪前的原始图像; (b): 小波去噪后的图像; (c): 在位置(4.5, 4)处的宽带CARS光谱Fig.6 CARS images of mouse alveolar tissue at 2 960 cm-1
(a): Original image; (b): De-noised using wavelets image; (c): CARS spectrum at (4.5, 4)

图6(b)是采用小波变换[11]的降噪方式处理图6(a)图像所得到的结果, 说明对于对比特征比较明显的CARS峰, 使用简单的小波变换便可以得到活体小鼠的离体肺泡组织在2 960 cm-1 C— H键清晰的分布图像。 我们最初的成像目的是希望得到每个像元里的CARS信号, 然后, 根据CARS信号分析像元里面物质成分。 但是, 从图6(c)的宽带CARS光谱信号来看, 在2 000 cm-1以内虽然有很丰富的拉曼谱信息, 由于信号的对比度比较差, 很难清晰地分辨此像元里面到底含有什么样的主成分。 图6(c)中的光谱信号强度本身就比较弱, 如果再采用抑制非共振背景背景的手段, 也会在一定程度上削弱共振信号的强度。 所以, 我们需要寻找新的手段, 在不削弱信号的情况下, 得到我们想要的结果。

3 结 论

通过已知退相时间的标准样品。 经时间延迟的方式, 然后, 根据测量结果进行单指数衰减拟合, 给出具体的时间, 再与标准样品的振动退相时间对比。 定量判断CARS属于二色CARS还是三色CARS的具体实现方法的同时, 开展生物学应用。

根据小鼠肺泡组织的宽带CARS信号, 在2 960 cm-1波数C— H化学键进行图像重构, 结果表明, 对于信号对比度比较高的CARS信号可以直接通过小波变换的方法直接降噪, 就可以得到比较清晰化学键的CARS图像。 但是, 由于非共振背景信号的存在, 多数成分的CARS信号对比度并不好, 而我们的最终目的是既要得到各个像元的成分是什么, 又要得到各自的百分比含量, 也就是既要定性也要得到定量的结果。 而文中所提到的抑制非共振背景信号的手段同时会削弱共振信号的强度, 所以, 我们需要另外找寻处理非共振背景信号的方法。 而定性定量结果对生物学成像来说, 可以用来判断组织或细胞是否正常, 这将在生物学领域及成分分析领域具有重要的应用价值。 但是, CARS信号强度与三阶非线性极化率系数的平方成正比, 并不是线性的关系, 所以, 对定量分析而言还有一段路要走。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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