UV-2550型紫外-可见分光光度仪(日本, Shimadzu公司), 圆二色谱仪(英国, Applied photophysics公司), Fluromax-4 荧光光谱仪(英国, Horiba公司), Nano ITC(美国, TA 公司), 傅里叶红外光谱仪(美国, PerkinElmer公司)。

盐酸阿霉素(AR)、 小牛胸腺DNA, 简称DNA(AR), 三羟甲基氨基甲烷(AR), 盐酸(AR), 所有溶液均由超纯水配制, 所有储液均在4 ℃低温保存。

紫外-可见光谱实验用UV-2550型紫外-可见分光光度计。 以0.05 mol· L^-1 Tris-HCl缓冲溶液控制pH为7.4, 固定DOX浓度为7.8× 10^-3 mol· L^-1, 逐渐增加固定浓度小牛胸腺 DNA 溶液(0~30 μ L)。

粘度实验在25 ℃的水浴中用乌氏粘度计完成, Tris-HCl缓冲溶液、 DNA溶液和不同比例的DOX+DNA溶液的流出时间通过秒表测量, 平行测三次求其平均值。

圆二色光谱实验在Applied photophysics公司的圆二色谱仪上进行, 测量使用1 mm光程的石英比色皿, 在温度25 ℃进行, 体系的测定通过滴加微量的DOX到已知浓度和体积的DNA溶液中进行。

荧光光谱实验在Fluromax-4荧光光谱仪上进行。 激发波长为467 nm; 固定DOX浓度为1× 10^-5 mol· L^-1; 用0.05 mol· L^-1 Tris-HCl缓冲溶液稀释配制不同浓度的DNA溶液, 测定发射波长在480~780 nm范围内DOX与不同浓度的DNA 结合的荧光发射光谱。

等温滴定量热实验在25 ℃下Nano ITC上进行。 为避免溶液中气泡影响滴定体积, 所有溶液要事先脱气。 DOX溶液装入250 μ L的注射器中, DNA溶液装入样品池中, 设定滴定时间间隔为300 s/5 μ L, 在持续搅拌的情况下滴加DOX药物于样品池中, 共滴50次。 对比实验通过测定DNA+缓冲溶液以及DOX+缓冲溶液的稀释热, 通过校正稀释热, 得到结合等温线, 所有的数据使用NanoAnalyze软件分析。

在pH 7.4的Tris-HCl缓冲溶液中, 扫描并记录DNA滴定DOX的紫外可见吸收图谱, 我们观察到依次加入DNA后, DOX在314 nm 出现等吸光点, 并在480 nm处显示电荷转移带, 如图1。

图1

Fig.1

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	图1 DOX与DNA作用的紫外光谱图Fig.1 UV-Vis spectra of the interaction between DOX with DNA

根据公式^[16]

cDNAεa-εf=cDNAεb-εf+1Ka(εb-εf)

式中: c_DNA为DNA的浓度, ε _f, ε _a和ε _b分别代表自由态、 与DNA完全结合和部分结合化合物的摩尔消光系数, 以c_DNA/(ε _a-ε _f)对c_DNA作图(图2), 截距可得DOX与DNA体系的结合常数K_a为6.50× 10⁴ mol^-1· L。

图2

Fig.2

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	图2 cDNA/(ε a-ε f)与cDNA关系图Fig.2 Plot of cDNA/(ε a-ε f) versus cDNA

通常我们可以依据粘度变化确定DNA与药物的结合方式。 实验于超级恒温水浴中恒温25 ℃进行, 以Tris-HCl缓冲液作空白测定t₀, DNA溶液测定t_control, 不同比例DNA+DOX测定t_complex, 每个样品连续测定三次取其平均值, 计算η '_sp(DOX存在) 和η _sp(DOX不存在) 时的增比粘度。 利用方程^[17]

η'sp/ηsp={(tcontrol-t0)/t0}/{(tcomplex-t0)/t0)}

DNA/DOX体系的粘度关系经由(η '_sp/η _sp)^1/3对c_DOX/c_DNA作图^[11]得图3。

图3

Fig.3

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图3 DNA/DOX体系的相对粘度与cDOX/cDNA浓度比关系Fig.3 Relationship between the concentration ratio of DNA/DOX and relative viscosity

图3显示出两个不同的效果, c_DOX/c_DNA比率在0~0.25, 复合物粘度增大, 在此过程中DOX嵌插进DNA的碱基, 促使复合物的粘度增大; 当c_DOX/c_DNA大于0.25, 相对粘度下降, 揭示了第二种类型的DOX/DNA络合物的形成。 这种现象表明了形成不同类型的DOX/DNA复合物, 其形成以第一种复合物为前提。 在这个模式中, DOX是部分地嵌插并且形成聚集的复合物。

控制c_DNA=7.2× 10^-4 mol· L^-1, pH 7.4和t=25 ℃, 逐渐滴加微量的DOX溶液, 利用圆二色谱仪得到DNA溶液与DNA+DOX溶液的CD光谱(图4)。

图4

Fig.4

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	图4 DNA与DOX的CD光谱图(0< cDOX/cDNA< 1)Fig.4 CD spectra of DNA and DOX (0< cDOX/cDNA< 1)

DNA的CD光谱包括一个由于碱基堆积出现在275 nm的正峰和一个由于DNA的螺旋性出现在245 nm的负峰。 随着药物浓度的增加, 245 nm处负峰强度减小, 275 nm处的正峰增加, 并且发生红移现象, 说明DNA的结构趋于紧密, 发生B-DNA向着A-DNA转变的趋势。 当DOX与DNA发生嵌插结合作用时, 使其双螺旋结构变得更加紧凑, 其构象了也发生了改变, 因而使DNA的CD谱中负峰强度大大增加。 这与粘度法得出的反应有嵌插结合的结论是一致的。

为了弄清反应驱动力的来源, 采用红外光谱仪测得了DNA和DOX及反应物的红外光谱如图5。

图5

Fig.5

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	图5 DNA, DOX, DNA-DOX复合物的红外光谱图Fig.5 IR spectra of DNA, DOX and DNA-DOX

图5为DNA, DOX和DOX-DNA复合物的傅立叶红外光谱。 根据文献[18]知B-型DNA特有的吸收谱带分别为1 073, 1 226和1 710 cm^-1; 1 073和1 226 cm^-1为DNA磷酸骨架对称伸缩振动和非对称伸缩振动的特征峰, 1 710 cm^-1是碱基的面C=O和C=N的伸缩振动。 当DOX加入到DNA中, 磷酸骨架1 073 cm^-1的对称伸缩振动消失, 1 226 cm^-1处的非对称伸缩振动几乎不受影响。 这显示阳离子DOX⁺与DNA的磷酸骨架发生结合, 它们之间存在静电吸引, 而1 226 cm^-1的非对称伸缩振动未发生改变, 表示DOX⁺与DNA的磷酸骨架的静电相互作用是有限的, 并且反应在特定的程度改变DNA的螺旋结构。 在1 710 cm^-1吸收谱带表明碱基反应消失, DNA双螺旋部分变性; 同时说明DOX的碳氢键与DNA的碱基通过疏水作用结合。 因此, 在DOX与DNA的结合过程中DOX⁺与DNA的磷酸骨架的静电作用是基础的, 在DOX的碳氢键与DNA的疏水性碱基之间的疏水作用可能作为驱动力^[10]。

图6为发射波长在480-780 nm范围内DOX与不同浓度的DNA结合的荧光发射光谱。

图6

Fig.6

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	图6 DOX与DNA作用的荧光发射图谱 DNA浓度: (0, 1.7, 2.6, 3.5, 4.3, 5.2, 6.0, 6.9, 7.8, 8.6, 9.5)× 10-6 mol· L-1Fig.6 Fluorescence emission spectra of the interaction of DOX and DNA cDNA: (0, 1.7, 2.6, 3.5, 4.3, 5.2, 6.0, 6.9, 7.8, 8.6, 9.5)× 10-6 mol· L-1

由图6可见, 随着DNA浓度的增加, 荧光强度也不断降低。 说明DNA对DOX荧光强度具有明显的猝灭作用, 是DOX荧光的良好的猝灭剂。 图7揭示了两种不同的效应, 当c_DOX/c_DNA< 0.25时, 荧光减弱很快, DNA/DOX体系的荧光显著猝灭; 当c_DOX/c_DNA> 0.25时, 荧光减弱趋于平缓, 几乎不发生变化, 也说明DNA与DOX之间发生了相互作用, 形成新的稳定复合物。

图7

Fig.7

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	图7 DNA/DOX体系的荧光强度与cDOX/cDNA比值的关系Fig.7 Relationship between fluorescence intensity and concentration ratio of cDOX/cDNA

为了弄清DOX与DNA的猝灭机制, 采用Stern-Volmer方程^[19]

F0F=1+Kqτ0[Q]=1+KSV[Q]

考察不同温度下荧光强度与DNA浓度间的变化规律, 以F₀/F对c_DNA作图(图8), 可求出猝灭速率常数K_q和Sterm-Volmer 猝灭常数K_SV, 结果见表1。

图8

Fig.8

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	图8 DNA与DOX结合的Stern-Volmer图Fig.8 Plot of Stern-Volmer between the binding of DNA and DOX

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 不同温度下DOX与DNA的猝灭常数 Table 1 Quenching constants of DOX and DNA at different temperatures T/℃ KSV/(L· mol-1) Kq/(L· s-1· mol-1) 25 2.34× 105 2.34× 1013 37 1.73× 105 1.73× 1013 45 1.41× 105 1.41× 1013

表1 不同温度下DOX与DNA的猝灭常数 Table 1 Quenching constants of DOX and DNA at different temperatures

由表1可以看出, 猝灭常数K_SV的值随温度的升高而降低, 表明该猝灭过程不受扩散控制。 不同温度下的K_q均远远大于2.0× 10¹⁰ L· (mol· s)^-1(扩散控制的各类猝灭剂对生物大分子的最大碰撞猝灭常数), 这进一步表明DOX与DNA体系的荧光猝灭过程是静态猝灭过程, 而不是动态碰撞猝灭^[20]。

为此, 采用修正后的荧光静态猝灭方程^[21]

logF0-FF=nlogKA+nlog[Dt]-[Pt]F0-FF

用 logF0-FF对log[Dt]-[Pt]F0-FF作图, 可求出不同温度下DOX与DNA的结合常数K_A与结合位点数n, 相关结果见表2。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 不同温度下DOX与DNA的结合常数与结合位点数 Table 2 Binding constant and binding-site numbers of DOX and DNA at different temperatures T/K n KA/(L· mol-1) 298.15 2.1 8.40× 104 310.15 2.1 7.06× 104 318.15 2.2 6.07× 104

表2 不同温度下DOX与DNA的结合常数与结合位点数 Table 2 Binding constant and binding-site numbers of DOX and DNA at different temperatures

利用Van’ t Hoff方程 , 计算DOX与DNA相互作用的焓变和熵变, 结合热力学公式得出反应的吉布斯自由能变化, 结果列于表3。

lnK=-ΔHRT+ΔSR

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 不同温度下DOX/DNA体系的热力学参数 Table 3 Thermodynamic parameters of DOX/DNA at different temperatures T/ K Δ G/ (kJ· mol-1) Δ H/ (kJ· mol-1) Δ S/ (J· K· mol-1) 298 -28.10 310 -28.73 -12.64 51.90 318 -29.14 ΔG=ΔH-TΔS=-RTlnKa

表3 不同温度下DOX/DNA体系的热力学参数 Table 3 Thermodynamic parameters of DOX/DNA at different temperatures

从表中可看出, DOX与DNA结合过程中Δ H< 0, Δ S> 0, 表明该过程的主要驱动力为静电作用力^{[22, 23]}。 同时由于过程放热而降低了DOX与DNA复合物的能量, 有助于稳定复合物。

DOX与DNA作用的等温滴定量热曲线见图9, 采用NanoAnalyze软件分析得到的热力学参数列于表4。

图9

Fig.9

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	图9 DOX与DNA作用的等温滴定量热曲线Fig.9 Isothermal titration curve for the interaction of DNA with DOX

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 25 ℃下DOX结合DNA的热力学参数 Table 4 Thermodynamic parameters of the binding of DOX and DNA site n Ka/(L· mol-1) Δ H/(kJ· mol-1) Δ G/(kJ· mol-1) TΔ S/(kJ· mol-1) First 1.36 9.23× 105 -8.02 -34.04 26.03 second 0.77 7.04× 103 51.15 -21.92 73.11

表4 25 ℃下DOX结合DNA的热力学参数 Table 4 Thermodynamic parameters of the binding of DOX and DNA

对于第一类结合, Δ H₁< 0, Δ S₁> 0是一个稍有放热而熵增明显的过程, 且结合平衡常数较大, 这两种情况都会引起过程放热, 所以第一类结合表现为焓-熵协同驱动过程, 驱动作用力主要为静电作用。

对于第二类结合, Δ H₂> 0, Δ S₂> 0 是吸热且熵增明显的过程, 结合平衡常数较小, 这可能是因为DOX的疏水平面部分较深地嵌插至DNA分子的疏水部分, 并且DOX进入之后又会使原来处于较深层疏水空腔的全部或部分溶剂水分子进入溶液本体, 转变为自由水分子, 使混乱度增加, 故表现为疏水作用为主的熵驱动过程。

一定的温度和压力下, 两类结合的Δ G值均为负值, 说明两类结合过程均可以自发地进行, 且生成的产物分子结构比较稳定。