便携式光谱系统包括光谱仪QE65000, 光源LS-1, 海洋公司的Y形光纤和计算机等部件, 其中光谱仪的范围为200~1 100 nm与光源LS-1的波长范围300~2 500 nm符合, 利用光谱仪配套的控制软件Spectrasuite来完成叶片可见光谱采集。 参数设置分别为: 累积时间30 ms, 扫描15次, 平滑度15。

利用TENSOR37傅里叶近红外光谱仪采集柑桔叶片的漫反射光谱。 仪器参数设置为: 扫描范围835~2 500 nm, 分辨率8 cm^-1。 同时附带InGaAs 检测器、 镀金积分球和标准背景板等附件。

用于实验的样品全部来自江西省万安县某果园种植基地, 2016年10月在基地高级农艺师的指导下采摘。 为了体现样品的差异性, 将采摘区域划分为5个。 每区域选取3棵柑桔树, 树之间的间距大于12 m, 分东南西北4个方向相同层采摘12片树叶, 共计180片。 叶片用自封袋装好标记, 带回实验室, 用去离子水冲洗干净且晾干。 采用实时荧光定量PCR方法筛选实验样品, 根据Jagoueix等^[8]报道的引物OI₁/OI₂c和Hocquellet等^[9]报道的引物A₂/J₅, 由南京金斯瑞公司合成。 O₁I/OI₂c和A₂/J₅序列分别为: 5’ -GCGCGTATCCAATACGAGCGGCA-3’ , 5’ -GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT-3’ , 5’ -TATAAAGGTTGACCTTTCGAGTTT-3’ , 5’ -ACAAAAGCAGAAATAGCACGAACAA-3’ 。 患病叶片PCR测试为阳性, 未患病叶片PCR测试为阴性, 结果如图1所示。 同时为了让样品呈现均匀性和代表性, 每类叶片选择30片共150片, 用缺素叶片来比对是因其症状与患黄龙病叶片相似。

图1

Fig.1

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	图1 柑桔叶片荧光定量PCR测试结果Fig.1 The results of fluorescent quantitative PCR test for citrus leaves

由图1可知, 采用OI₁/OI₂c作为引物的PCR测试结果更加明晰效果更好, 图中黄龙病轻中重依次呈现出亮带, 并随病情的等级颜色越来越亮, 而正常叶片并没有出现亮带, 缺素叶片出现的亮带可能与叶片缺乏营养元素有关, 但与黄龙病叶片的亮带不同, 具体如表1所示^[10]。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 样本种类 Table 1 Sample categories 样品数量 级别 叶片感染情况 30 正常 未感染黄龙病症状, PCR测试阴性 30 轻度黄龙病 轻度感染症状, PCR测试阳性 30 中度黄龙病 中度感染症状, PCR测试阳性 30 重度黄龙病 重度感染症状, PCR测试阳性 30 缺素 未感染黄龙病症状, PCR测试阴性

表1 样本种类 Table 1 Sample categories

综合考虑染病情况对柑桔产量的影响与荧光定量PCR检测结果将实验样品大致的分为5级, 1级为轻度黄龙病, 2级为中度黄龙病, 3级为重度黄龙病, 4级为缺素, 5级为正常^[11]。 最后对样品编号, 等待对其光谱进行采集。

1.3.1 可见光谱采集

叶片光谱采集需对光源和光谱仪预热20 min左右。 然后采集暗电流谱D和聚四氟乙烯标准白板的入射谱R, 将样品尽可能平铺在白板上采集光强谱S。 将样品放在白板上, 光源通过光纤照射在样品上, 一部分直接反射被光纤检测, 一部分经叶片吸收透过叶片再经白板反射给叶片, 再经叶片吸收后被光纤接收检测。 因为叶片厚度较小, 光容易透射, 所以采用此方式采集。 在该期间, 连续采集叶片任意三点光谱, 再取平均。 通过式(1)计算吸光度A, 获得叶片最终可见光谱进行后续处理^[12]。

Aλ=-lgSλ-DλRλ-Dλ(1)

1.3.2 近红外光谱采集

在实验室环境下, 对TENSOR37傅里叶近红外光谱仪预热30 min后采集叶片近红外光谱。 期间尽量保证叶片平整且避开叶脉。 每采集完一个样品光谱后采集一次参比, 采集与前面相同区域任意四点的光谱, 取平均作为最终近红外光谱用作后续分析。

利用拉格朗日平均法来确定两种技术组合后的模型尝试提高判别模型的预测精度。 该方法不考虑协方差结构中可能存在的预测误差探讨传统偏最小二乘判别模型结果。 基于拉格朗日平均法这一特点, 多元线性回归是在单一技术判别模型的基础上获得组合模型的输入变量, 建立MLR模型获得最终预测值, 最终回归到单一技术判别模型预测源值。 平均模型的判别公式为

Y=αY1+βY2+b(2)

式(2)中, Y为最终预测值, Y₁和Y₂为单一技术模型预测源值。 三个参数α , β 和b是利用普通偏最小二乘方法求解获得。 其中α 和β 为权重矢量, 是通过将Y₁和Y₂当作输入时建立PLS模型, 从此时的判别模型线性回归系数中获得, 且不需合并; b为截距, 在最终预测值和单一技术模型预测源值之间的内偏置校正项^[13]。

图2为轻度黄龙病、 中度黄龙病、 重度黄龙病、 缺素和正常5类叶片的可见和近红外代表性光谱。 在图2(a)位于原始光谱波长560和760 nm两处存在两个比较明显的反射峰, 主要原因是叶片中包含的多种有机物由C— H, O— H, N— H等氢基团组合而成, 叶绿素的强吸收带位于540~640和750~850 nm两个波段内, 黄龙病叶片的叶绿素较正常叶片少, 导致在570和760 nm两处的反射峰高于正常叶片, 并随着黄龙病轻重等级反射峰逐渐升高, 缺素叶片在560和760 nm处反射峰低于正常叶片, 可能跟叶片缺乏营养元素有关。

图2

Fig.2

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图2 340~1 140和830~2 500 nm两波段轻度黄龙病、 重度黄龙病、 缺素和正常五类叶片典型光谱Fig.2 Typical spectra of five kinds of leaves including slight HLB, moderate HLB, serious HLB, Nutrient deficiency and normal in 340~1 140 and 830~2 500 nmdifferent wavelength respectively

在图2(b)中位于原始光谱1 930和1 450 nm两处有两个比较明显的吸收峰。 叶片中含大量O— H等基团, 1 930 nm处的吸收峰主要由O— H基团的伸缩和变形振动造成^[14]。 黄龙病叶片的吸收峰低于缺素、 正常2类叶片, 主要原因可能是叶片在吸收水分时黄龙病会产生阻碍作用, 导致叶片吸光度低, 并随轻重等级, 吸收峰逐渐降低, 重度黄龙病叶片吸光度最低。 位于1 450 nm处的吸收峰, 主要是水和糖类的O— H键一级倍频伸缩振动引起^[15]。 缺素叶片在1 930和1 450 nm两处的吸光度高于黄龙病叶片可能由于缺乏的营养元素对光的依赖性不强导致。

从中可以看出在可见光谱中350~500和1 000~1 135 nm两波段光谱接近直线, 对整条光谱影响小, 故除去该波段范围。 近红外光谱835~1 000 nm波段光谱亦接近直线, 是因该范围内叶片吸光度主要是官能团3~4级倍频引起的, 对整条光谱影响有限, 故亦除去该波段光谱, 最终得到可见和近红外光谱如图3(a)和(b)所示。

图3

Fig.3

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	图3 500~1 000和1 000~ 2 500 nm两波段范围轻度、 中度、 重度黄龙病、 缺素和正常五类叶片的典型光谱Fig.3 Typical spectra of five kinds of leaves including slight HLB, moderate HLB, serious HLB, Nutrient deficiency and normal in 500~1 000 and 1 000~ 2 500 nm different wavelength respectively

叶片在存储过程有25个样品遭到不同程度损坏, 为了不影响结果, 在实验过程中给予剔除。 其中包括轻度黄龙病叶片10个, 中度度黄龙病叶片5个, 重度黄龙病叶片6个, 缺素叶片2个, 正常叶片2个。 依据3∶ 1的比例将剩余样品随机划分为建模集和预测集两部分, 其中建模集包括95个样品(轻度黄龙病14个、 中度黄龙病叶片18个, 重度黄龙病叶片19个, 缺素叶片22个、 正常叶片22个), 剩余30个作为预测集样品, 用来评价判别模型的预测效果。

2.2.1 基于光谱直接拼接的定性模型建立及验证

偏最小二判别分析实质上是基于特征变量的一种解析方法, 通常用于模型分类。 实验中采用分类变量代替真值, 对预测结果进行分类, 如式(3)所示。

y˙=∑i=12222kixi+b(3)

式(3)中, y˙为分类向量, 根据叶片的特性给予样品分类向量值。 试验中设为[2 4 6 8 10], 2为轻度黄龙病叶片, 4为中度黄龙病龙病叶片, 6为重度黄龙病叶片, 8为缺素叶片, 10为正常叶片, 两类变量的中间值为分类阈值。

将500~1 000 nm范围内的可见光谱和1 000~2 500 nm范围内的近红外光谱结合真值分别建立柑桔黄龙病PLS-DA判别模型, 并将两个波段光谱直接拼接亦建立黄龙病PLS-DA判别模型。 模型结果如表2所示。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 不同波段范围PLS-DA测试结果 Table 2 The result of PLS-DA in different wavelengths 波段范围 /nm 主成分 因子数 建模相 关系数 预测相 关系数 建模均方 根误差 预测均方 根误差 误判率 /% 500~1 000 10 0.89 0.92 1.25 1.11 37 1 000~2 500 18 0.99 0.98 0.50 0.72 7 500~2 500 10 0.96 0.95 0.49 0.70 7

表2 不同波段范围PLS-DA测试结果 Table 2 The result of PLS-DA in different wavelengths

从表2中可以发现, 光谱拼接的PLS-DA模型预测效果比单一范围模型效果有所改善, 虽误判率与1 000~2 500 nm范围内的相同, 但预测相关系数(R_P)和预测均方根误差(RMSEP)均变好。 因可见和近红外光谱在采集过程中可能受到各种外界环境的干扰, 故尝试对原始光谱进行预处理, 以降低影响和减少负面干扰, 进一步提高模型预测精度。

采用Savitzke-Golay平滑(S-G)、 一阶导、 二阶导的预处理方法对模型进行优化, 经比较, 二阶导的预处理方法模型效果更佳。 该方法在放大光谱有效信息的同时消除了光谱基线漂移, 图4和图5为采用二阶导预处理后5类叶片的可见光和近红外代表性谱图。 从图4中可发现5类柑桔叶片的可见光谱位于690 nm处的反射比明显不同, 图5中5类柑桔叶片的近红外光谱吸收峰不同之处位于1 850 nm处。

图4

Fig.4

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图4 500~1 000 nm范围轻度黄龙病、 中度黄龙病、 重度黄龙病、 缺素和正常五类叶片二阶导数代表性光谱Fig.4 Representative spectra of five kinds of leaves including slight HLB, moderate HLB, serious HLB, Nutrient deficiency and normal after second derivative in 500~1 000 nm

图5

Fig.5

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图5 1 000~2 500 nm范围轻度黄龙病、 中度黄龙病、 重度黄龙病、 缺素和正常五类叶片二阶导数代表性光谱Fig.5 Representative spectra of five kinds of leaves including slight HLB, moderate HLB, serious HLB, Nutrient deficiency and normal after second derivative in 1 000~2 500 nm

二阶导光谱的PLS-DA模型结果如表3所示, 从表3可知二阶导消除原始光谱中基线漂移, 有效信息更加明显, 判别模型效果均显著提高。 从表3中可知可见光谱范围模型相比于原始光谱模型误判率明显下降为13%, 近红外光谱范围模型误判率虽未变, 但主成分因子数(PCs)减小为6个, 光谱拼接模型均好于单一波段判别模型。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 二阶导后不同波段的PLS-DA预测结果 Table 3 The result of PLS-DA in different wavelengths after second derivative 波段范围 /nm 主成分 因子数 建模相 关系数 预测相 关系数 建模均方 根误差 预测均方 根误差 误判率 /% 500~1 000 13 0.98 0.97 0.48 0.67 13 1 000~2 500 6 0.98 0.97 0.48 0.70 7 500~2 500 13 0.98 0.97 0.48 0.67 3

表3 二阶导后不同波段的PLS-DA预测结果 Table 3 The result of PLS-DA in different wavelengths after second derivative

该模型均方根误差与主成分数关系如图6所示, 从中可知在主成分因子数为13时, 总误判率达到最小, 模型结果散点图如图7所示。

图6

Fig.6

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	图6 主成分因子数决定图Fig.6 Diagram of principal components number determination

图7

Fig.7

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	图7 建模集和预测集样品的分类变量和预测值Fig.7 Classified variables and actual values of leaves in calibration set and prediction set

从图7中可得光谱联用判别模型建模相关系数(R_C)为0.98, R_P为0.97, 建模均方根误差(RMSEC)为0.48, RMSEP为0.67, 预测集样品中只有一个重度黄龙病被误判为缺素, 故总误判率为3%。 二阶导光谱直接拼接模型亦明显优于原始光谱直接拼接模型, 总误判率最低。

2.2.2 基于光谱归一化拼接的定性模型建立及验证

归一化作为一种简化变量的计算方式, 用来消除光谱量纲之间由光程差引起的变化, 以解决数据自身的可比性。 对光谱变量按公式4进行归一化处理, 使光谱数据范围处于同一级别, 用此来综合比对分析。

x* =x-μσ(4)

式(4)中, μ 为所有样品数据的均值, σ 为所有样品数据的标准差。

图8

Fig.8

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	图8 500~1 000 nm范围轻度黄龙病、 中度黄龙病、 重度黄龙病、 缺素和正常五类叶片二阶导归一化的代表性光谱Fig.8 Representative spectra of five kinds of leaves including slight HLB, moderate HLB, serious HLB, Nutrient deficiency and normal after normalized in 500~1 000 nm

图8为5类样品可见光谱在二阶导后归一化的谱图, 图9为5类样品近红外光谱在二阶导后归一化的谱图, 根据两图可知可见光谱的反射比与近红外光谱的吸光度处于同一个范围内, 利用归一化将两波段内光谱在量纲上进行统一, 建立光谱归一化的柑桔黄龙病PLS-DA模型尝试改善模型效果和预测精度的可行性。

图9

Fig.9

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	图9 1 000~2 500 nm范围轻度黄龙病、 中度黄龙病、 重度黄龙病、 缺素和正常五类叶片二阶导归一化的代表性光谱 分别建立了PLS-DA模型, 模型结果见表4所示。 从表4中可知光谱拼接模型效果优于单一波段模型, RP最大为0.96, RMSEP最小为0.73, 总误判率为7%。 但与归一化前的模型相比, 效果变差, 可能是因归一化去除了光谱的部分有效信息造成的。Fig.9 Representative spectra of five kinds of leaves including slight HLB, moderate HLB, serious HLB, Nutrient deficiency and normal after normalized in 1 000~2 500 nm

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 光谱归一化后不同波段的PLS-DA预测结果 Table 4 The result of PLS-DA in different wavelengths after normalized 波段范围 /nm 主成分因 子数 建模相 关系数 预测相 关系数 建模均方 根误差 预测均方 根误差 误判率 /% 500~1 000 9 0.96 0.95 0.80 0.91 27 1 000~2 500 14 0.99 0.96 0.16 0.85 13 500~2 500 8 0.97 0.96 0.68 0.73 7

表4 光谱归一化后不同波段的PLS-DA预测结果 Table 4 The result of PLS-DA in different wavelengths after normalized

2.2.3 基于模型平均思想的定性模型建立及验证

多元线性回归分析(MLR)是一种基于变量间数理统计的分析方法, 以多个变量的光谱数据作为基础, 通过对光谱矩阵的结构进行分析研究, 寻求出矩阵间的依赖关系。 将两个不同波长范围内的二阶导光谱分别进行PLS全交互验证, 得到相应的截距分别为11.7和1.0, 预测如式(5)和式(6)所示

Y1=∑i=1665αixi+11.7(5)Y2=∑k=11557βkxk+1.0(6)

由式(5)和式(6)获得的预测源值Y₁和Y₂, 结合真值建立MLR平均模型。 通过回归系数可得MLR公式的系数分别为0.517和0.556, MLR公式见式(7)所示。

Y=0.516Y1+0.556Y2-0.430(7)

由式(7)获得最终的预测值, 得到平均模型结果如下:

(1)建模集样品中2个轻度被误判为中度, 2个中度被误判为重度, 1个重度被误判为中度, 2个重度被误判为缺素以及1个正常被误判为缺素。

(2)预测集样品中仅有1个缺素被误判为正常, 故MLR平均模型的总误判率为7.2%。

与前两种策略相比, MLR平均模型效果最差, 大概是由于两波段光谱变量之间差距较大且存在共线性导致。

2.2.4 光谱联用模型对比分析

将500~1 000和1 000~2 500 nm两波段范围内光谱联用建立MLR平均模型, 与两光谱拼接建立的PLS-DA判别模型进行比较分析, 得到结果如下:

(1)可见光谱和近红外光谱联用建立的MLR平均模型, 预测能力最差, 虽然R_P较高为0.98, RMSEP较低为0.62, 但模型总误判率最大为7.2%。

(2)对可见光谱和近红外光谱进行二阶导处理, 在500~2 500 nm范围直接拼接后建立的PLS-DA判别模型, 模型效果最好, 总误判率最小为3%。

(3)与光谱归一化拼接PLS-DA模型和MLR平均模型相比, 光谱直接拼接的PLS-DA模型总误判率最低, 且后者模型更加简单。