1.1.1 仪器

GZX-9146MBE型数显鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂); SZCL-2数显智能控温磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司); UV-Ⅲ 型手提式紫外分析仪(北京市新技术应用研究所); Black Comet BLK-CXR-SR型光纤光谱仪(美国Stellar Net仪器有限公司); FLS920型荧光光谱仪(英国爱丁堡仪器公司); BLACK-CS-R型微型光纤光谱仪(美国Stellar Net仪器公司)。

1.1.2 试剂

锌酞菁(TCI 公司); 3-硝基邻苯二甲腈; 3-巯基-1-丙基磺酸钠; 二甲基亚砜(DMSO); N-N二甲基甲酰胺 (DMF); 1, 3-二苯基异苯并呋喃 (DPBF)。 其他试剂均购自阿拉丁化学试剂有限公司, 所有试剂均为分析纯。

1.2.1 水溶性锌酞菁的合成

称取2.675 0 g 3-硝基邻苯二甲腈和3.171 0 g 3-巯基-1-丙基磺酸钠置于50 mL圆底烧瓶中, 加入20 mL干燥的DMSO, 在室温搅拌下通入N₂, 之后又加入2.671 0 g无水碳酸钾继续搅拌1.5 h, 然后将反应混合物加热到58 ℃搅拌4 h。 冷却至室温后, 将反应混合物过滤除去沉淀物, 于滤液中加入400 mL乙酸乙酯形成白色沉淀, 粗沉淀物通过过滤收集并用乙酸乙酯洗涤。 干燥后得到的粗产品用30 mL甲醇重结晶, 得到3-(3-磺酸丙基硫基)邻苯二甲腈钠盐。 将0.552 2 g 3-(3-磺酸丙基硫基)邻苯二甲腈钠盐溶解在12 mL去离子水中, 在30 ℃时加入0.017 9 g钨酸钠和0.110 mL冰醋酸, 在55~60 ℃时加入0.511 mL 30%过氧化氢, 在58 ℃下搅拌2.5 h。 冷却后加入0.069 0 g无水氯化锂, 继续冷却至9 ℃, 过滤收集沉淀物, 得到3-(3-磺酸丙基磺酰基)邻苯二甲腈锂盐。 将3-(3-磺酸丙基磺酰基)邻苯二甲腈锂盐干燥后放入小试管内, 在220 ℃加热2.5 h, 可观察到熔融并有黄色的杂质产生, 试管底部颜色变成绿色。 测量光谱可知有空心酞菁生成。 将制得的空心酞菁进行索氏提取。 取50 mg提取后的空心酞菁, 5 mL DMF, 13 mg醋酸锌, 于80 ℃加热 1 h 得到水溶性锌酞菁, 合成路线如图2所示。

图2

Fig.2

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	图2 水溶性锌酞菁的合成路线 试剂和条件: (i) DMSO, K2CO3, 58 ℃, 4 h; (ii) H2O2, Na2WO4, CH3COOH, 58 ℃, 2.5 h; (iii) 220 ℃, 2.5 h; (iv) DMF, 80 ℃, 1 hFig.2 Synthetic route of water-soluble zinc phthalocyanine Reagents and conditions: (i) DMSO, K2CO3, 58 ℃, 4 h, (ii) H2O2, Na2WO4, CH3COOH, 58 ℃, 2.5 h, (iii) 220 ℃, 2.5 h, (iv) DMF, 80 ℃, 1 h

1.2.2 水溶性铜酞菁的合成

取50 mg经索氏提取后的空心酞菁, 5 mL DMF, 13 mg醋酸铜, 于80 ℃加热1 h得到水溶性铜酞菁。

1.3.1 紫外-可见吸收光谱

取少量酞菁化合物固体于小瓶中, 分别加入少量水或N, N-二甲基甲酰胺 (DMF) 配制成母液备用, 并超声2 min使其完全溶解。 溶剂使用前需干燥重蒸, 测定温度为室温22 ℃, 而且所有待测溶液均为空气饱和。 吸收光谱的测量在光程1 cm的石英比色皿中进行, 使用空白溶剂做参比, 稀释母液使得670 nm处的吸光度为1.0± 0.1。

1.3.2 荧光光谱

取少量酞菁化合物固体于小瓶中, 用少量水或DMF溶解, 为了避免荧光测试中的自吸收, 调节待测溶液在激发波长处的吸光度为0.090± 0.010。 将此溶液倒入四面透光的石英比色皿, 然后置于荧光光谱仪中测定荧光光谱。

1.3.3 荧光量子产率和荧光寿命

利用公式Φ _f= Φf0F_sA₀ ns2/(F₀A_S n02)计算荧光量子产率, 其中Ф _f为荧光量子产率, 0为使用的参比化合物, s为样品化合物, F为荧光积分强度, A为激发波长处的吸光度, n为溶剂的折射率。 本实验以ZnPc的DMF溶液作为参比, 其荧光量子产率为0.30^[10]。 荧光寿命采用与时间相关的单光子计数(TCSPC)法测量, 使用670 nm(50 ps脉冲宽度)激发, 检测峰值处的荧光衰减。 荧光寿命值用仪器自带的F900软件计算。

1.3.4 单线态氧量子产率

取少量酞菁于样品瓶中, 用DMF溶剂溶解, 调节溶液在669 nm处吸光度约为0.9。 取少量1, 3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)加入DMF 溶解, 配置成DPBF浓溶液, 并在四面透光的石英比色皿中加入少量配制好的酞菁溶液, 再滴加适量DPBF溶液, 调整石英比色皿中溶液的浓度, 使其在410 nm处的吸光度约为0.7。 然后按一定时间间隔进行光照, 记录该照射后波长为410 nm处的吸光度。 大约记录15个数据后停止。

酞菁在紫外-可见吸收光谱中有两个特征吸收峰, 分别是B带(300~400 nm) 和Q带(650~700 nm), B带相对于Q带来说吸收强度较弱。 酞菁的多数性质与应用都与其Q带的吸收峰有关, 酞菁的中心原子不同, Q带的最大吸收波长也会发生变化。 本文合成了带有四个3-磺基丙基磺酰基的空心酞菁和两种不同中心原子的水溶性金属酞菁, 并与ZnPc的性质进行了比较。

图3为合成的三种水溶性酞菁H₂PcR₄, ZnPcR₄, CuPcR₄在水(a)和DMF中(b)的紫外-可见吸收光谱。 由图可见三种产物均有酞菁B带与Q带的特征吸收峰, 且与锌酞菁的吸收光谱相似。 图3(a) H₂PcR₄在水中的吸收光谱Q带裂分为Q_x和Q_y带(分别为656和679 nm), 这是典型的H₂Pc的紫外-可见吸收光谱; 而ZnPcR₄和CuPcR₄在水中的吸收光谱则都在664 nm出现窄而强的Q带。 由图3(b)可见, H₂PcR₄, ZnPcR₄, CuPcR₄在DMF中的吸收光谱与ZnPc的吸收光谱峰的形状基本相似, 说明侧链的引入并未影响其在非水溶剂中的Q带吸收光谱。

图3

Fig.3

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	图3 酞菁在水(a)和DMF(b)中的紫外-可见吸收光谱Fig.3 UV-Vis absorption spectra of phthalocyanines in water (a) and DMF (b)

图4为H₂PcR₄, ZnPcR₄, CuPcR₄在水(a)和DMF中(b)的归一化荧光发射光谱。 图5为H₂PcR₄, ZnPcR₄和CuPcR₄在水中的归一化荧光激发光谱。 由图4(a)可见, 在水中610 nm处激发时, ZnPcR₄和CuPcR₄的荧光发射带分别在677和680 nm处, 斯托克斯位移值分别为14和16 nm; 同样的条件下H₂PcR₄的荧光发射带则出现在689 nm处, 其斯托克斯位移值为33 nm。 由图4(b)可见, 在DMF中610 nm处激发时, 引入四个吸电子基团3-磺基丙基磺酰基所合成的H₂PcR₄, ZnPcR₄和CuPcR₄与ZnPc相比, 其荧光发射光谱的形状并未改变, 但其最大荧光发射波长均发生10 nm以上的红移。 引入吸电子基团之后由于其较大的原子轨道线性组合系数使得HOMO能级稳定性降低, HOMO能级和LOMO能级之间的能级差变小, 从而导致红移的发生^[11]。 由图5可见, 三种水溶性酞菁的荧光激发光谱均类似于相应的吸收光谱, 并且是荧光发射光谱的近镜像。

图4

Fig.4

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	图4 酞菁在水(a)和DMF (b)中的归一化荧光发射光谱(610 nm激发)Fig.4 Normalized fluorescence emission spectrum of phthalocyanines in water (a) and DMF (b) with excitation at 610 nm

图5

Fig.5

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	图5 酞菁在水中的归一化荧光激发光谱(700 nm发射) 2.3 荧光量子产率及荧光寿命Fig.5 Normalized fluorescence exitation spectrum of phthalocyanines in water with emission at 700 nm

荧光量子产率是激发态分子中通过发射荧光而回到基态的分子占全部激发态分子的分数。 表1为H₂PcR₄, ZnPcR₄, CuPcR₄在水和DMF中的光物理数据。 图6为H₂PcR₄, ZnPcR₄, CuPcR₄在水中通过50 ps激光脉冲在672 nm激发的荧光衰减曲线。 由表1可见, 三种水溶性酞菁中ZnPcR₄的荧光量子产率最高, CuPcR₄的荧光量子产率最低。 这里有三种因素影响荧光量子产率和荧光寿命: (1)分子聚集体形成会降低效率, 因聚集体不发光。 这一影响在水溶液中发生。 比较水中和DMF中的吸收光谱, 可以发现在水中的谱带变宽, 且B带相对强度变大, 这些是聚集的特征。 这就解释了每个物质在水中的荧光效率低于其在DMF中的效率的原因。 (2)金属离子的开壳层效应, 这一影响在CuPcR₄发生, 因Cu²⁺属于开壳层离子, 即d层有未成对电子和半空轨道, 受激发的酞菁π 电子易填充d轨道而去激发, 显著降低发光的机会。 所以CuPcR₄的荧光效率总是最低。 (3)激发态质子化或去质子化, 都会降低荧光效率。 在每个酞菁分子中既有磺酸基的酸性基团也有八个氮的碱性基团。 比如在水中MPc-RS O3-吸收光变成激发态[MPc-RS O3-]^* , 激发态会比较容易质子化: [MPc-RSO₃Na]^* +H₂O[MPc-RSO₃H]^* +NaOH, [MPc-RSO₃H]^* [MPc-RSO₃H]+hν 。 这样就有两个发光体存在, 通常[MPc-RSO₃H]^* 的寿命更短。 未取代的ZnPc在DMF中只有一个荧光寿命, 为3.44 ns^[12], 而H₂PcR₄, ZnPcR₄, CuPcR₄在水溶液中的荧光则呈双指数衰减, 即荧光寿命的数值有两个, H₂PcR₄的荧光寿命分别为1.64和4.74 ns, 其中1.64 ns占77%, 4.74 ns占23%; ZnPcR₄中, 1.88 ns占69%, 2.93 ns占31%; CuPcR₄中, 2.28 ns占45%, 5.01 ns占55%; 这些可以归结为激发态质子化或去质子化的结果。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 酞菁的光物理数据 Table 1 Photophysical data of Pcs solvent λ abs /nm λ em /nm Φ f τ f /ns chi H2PcR4 water 656 689 0.018 1.64, 4.74(0.23) 1.14 CuPcR4 water 664 680 0.000 42 2.28, 5.01(0.55) 1.03 ZnPcR4 water 663 677 0.058 1.88, 2.93(0.31) 1.01 H2PcR4 DMF 667 695 0.13 CuPcR4 DMF 666 691 0.001 3 1.93, 4.90(0.46) 1.26 ZnPcR4 DMF 667 698 0.13 1.30, 4.41(0.57) 1.4 ZnPc DMF 667 681 0.3 3.44 1.39 注: λ abs为最大吸收波长; λ em为最大荧光发射波长; Ф f为荧光量子产率; τ f为荧光寿命

表1 酞菁的光物理数据 Table 1 Photophysical data of Pcs

图6

Fig.6

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	图6 酞菁水溶液的荧光衰减曲线 激发: 670 nm激光(50 ps脉冲宽度); 发射: 680 nmFig.6 Fluorescence decay curve of phthalocyanines in water Excitation: 670 nm laser (50 ps pulsed), Emission: 680 nm

Pc在O₂存在下光照激发时, 产生Pc的激发三重态, 然后能量从Pc的激发三重态转移到O₂, 从而产生¹ O2[13]。 单线态氧又称激发态氧分子, 是基态氧分子(三重基态)被激发后得到, 比分子氧的正常状态(三重基态)反应活性大。 在光敏化反应中, 激发态的光敏剂将能量传递给基态氧分子, 使基态氧分子变成单线态氧。 单线态氧很不稳定, 不能直接测出其含量。 在实验室中, 可利用单线态氧捕捉剂DPBF对其进行间接测定。 DPBF对单线态氧很敏感, 与其反应速度快, 我们可以通过测定DPBF的含量变化来确定单线态氧的含量。 单线态氧具有很强的氧化性, 可以用作治疗肿瘤的药物。 产生单线态氧的效率越高, 抗肿瘤效果越好。 单线态氧量子产率(Ф _Δ ) 是评价PDT光敏剂性能的主要参数。

图7为加入单线态氧捕捉剂DPBF后, 含光敏剂CuPcR₄, H₂PcR₄和ZnPcR₄的DMF溶液的吸收光谱随670 nm光照时间的变化图。 如图所示, 随着时间的增加, 在410 nm处DPBF的吸收强度不断降低, 这表明DPBF逐渐被分解, 即单线态氧不断产生^[14]。 同时酞菁的吸收峰未变化, 表明它只是吸收和传递光能。 如果没有光照, 或没有酞菁, 或通氮气除氧则DPBF的吸收峰均不变, 这些事实表明DPBF的降解属于光敏氧化反应。

图7

Fig.7

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	图7 酞菁的DMF溶液中DPBF吸收光谱变化图, 插图: 410 nm处DPBF吸光度拟合曲线 DPBF吸光度的变化近似为线性衰减曲线, 符合动力学零级反应公式Fig.7 The change of absorption spectrum of DPBF in the presence of CuPcR4 (a), H2PcR4 (b) and ZnPcR4 (c) in DMF with irradiation at 670 nm. Inset: the plot of DPBF absorbance at 410 nm against time and the fitting

零级反应公式

At=kt+c

图7中插图为410 nm处DPBF的吸光度衰减拟合曲线。 由图可见, 曲线的斜率即为单线态氧的产生速率(k), 其中ZnPcR₄的斜率最大, CuPcR₄的斜率最小, 表明单线态氧的产生速率ZnPcR₄最快, H₂PcR₄次之, CuPcR₄最慢。

表2为DMF中CuPcR₄, H₂PcR₄, ZnPcR₄和ZnPc的光化学数据。 中心元素不同的酞菁, 其三重态量子产率也不同, 使得单线态氧量子产率不同。 如表2, 单线态氧量子产率 ZnPcR₄最大, H₂PcR₄次之, CuPcR₄最小。 由表2中Ф _Δ 值可以看出, ZnPcR₄和H₂PcR₄均是很好的光敏剂, 且ZnPcR₄好于H₂PcR₄。 从这些结果可以得出结论, ZnPcR₄和H₂PcR₄是很稳定的¹O₂敏化剂, 这使其可适合于生物医学应用如PDT和PIT。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 DMF中酞菁的光化学性质 Table 2 Photochemical data of phthalocyanines in DMF H2PcR4 CuPcR4 ZnPcR4 ZnPc Φ Δ 0.24 0.079 0.35 0.65

表2 DMF中酞菁的光化学性质 Table 2 Photochemical data of phthalocyanines in DMF