F-7000荧光分光光度计(日本日立高新技术公司); UV-2550紫外-可见分光光度计(日本日立高新技术公司); DC-4006型高精度恒温水浴槽(上海维菱科学仪器有限公司); 牛血清白蛋白(BSA, Sigma公司), 用Tris-HCl缓冲液配成2.0× 10^-5 mol· L^-1的储备液, 4 ℃避光保存; 人参皂苷20S-Rh2, 20R-Rh2(本实验室自制, 纯度> 98%), 均用二甲基亚砜(DMSO)配成10 mmol· L^-1标准溶液, 4 ℃避光保存。 其余试剂均为国产分析纯, 实验用水为超纯水。

1.2.1 紫外吸收光谱测定

精密量取人参皂苷20S-Rh2, 20R-Rh2标准溶液0, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2和0.3 mL, 分别置10 mL容量瓶中, 加入BSA溶液(2.0× 10^-5 mol· L^-1)0.05 mL, Tris-HCl缓冲液(pH 7.40)定容, 于310 K恒温水浴中作用20 min, 以相同条件下的空白试剂为参比, 在200~400 nm范围内扫描测定各溶液的紫外吸收光谱。

1.2.2 荧光光谱和恒波长同步荧光光谱测定

精密量取人参皂苷20S-Rh2, 20R-Rh2标准溶液0, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 mL分别置于10 mL容量瓶中, 加BSA溶液(2.0× 10^-5 mol· L^-1)0.5 mL, 用Tris-HCl缓冲液(pH 7.40)定容, 于310 K恒温水浴中作用20 min, 以相同条件下的空白试剂为参比, 扫描测定各溶液在290~450 nm 区间的荧光光谱, 仪器参数: 激发波长280 nm, 激发与发射狭缝宽度均为5 nm, 电压250 V。

同时测定各溶液的恒波长同步荧光光谱, 精密量取人参皂苷20S-Rh2和20R-Rh2标准溶液0, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.3 mL分别置10 mL容量瓶中, 加BSA溶液(2.0× 10^-5 mol· L^-1)0.5 mL, Tris-HCl缓冲液(pH 7.40)定容, 分别设置Δ λ =15 nm、 起始发射波长255 nm和Δ λ =60 nm、 起始发射波长300 nm, 扫描激发波长范围均为240~340 nm。

1.2.3 分子对接

分子对接研究采用包含丰富功能模块的Schrö dinger药物发现软件包(Schrö dinger, LLC, New York, NY, 2015)完成^{[15, 16, 17]}。 目标蛋白选择与BSA在氨基酸序列、 高级结构及生理功能上均高度相似的人血清白蛋白(human serum albumin, HSA), 其三维结构信息取自蛋白质晶体结构数据库(PDB, http://www.rscb.org/pdb/, PDB ID: 4IW1)。 在对接前, 分别针对大分子蛋白和配体小分子结构进行优化处理^[18]。 其中, 由蛋白质准备向导模块(protein preparation wizard)完成蛋白质准备, 包括添加缺失的氢原子和氨基酸残基, 对氢键和氨基酸残基取向进行优化, 对质子化状态进行调整, 删除所有异组分和水分子, 并进行整体结构优化; 配体准备使用Mastro10.1辅助设计平台绘制分子的三维结构, 分子能量通过Macro Model模块的液体模拟全原子力场方法(OPLS-2005)优化, 采用Epik模块预测pKa值、 多种互变异构体及可能在特殊条件下存在的离子化状态, 通过GB/SA(generalized-born/surface-area)模块模拟溶剂效应。 经处理的蛋白质和配体分子, 采用网格对接模块(glide docking)在标准精度(standard precision, SP)下进行对接。 根据对接得分筛选关键氨基酸残基, 分析相关作用力类型, 并使用Amber力场的MM-GBSA方法(molecular mechanics/generalized born surface area)计算总结合能Δ G_bind, 其中, 溶剂化模型设置为VSGB(溶剂为水), 力场选择为OPLS-2005, 其他参数设置为默认。

鉴于紫外吸收光谱具有针对性反映蛋白质二级结构变化的能力, 首先测定BSA与人参皂苷20S-Rh2和20R-Rh2相互作用体系在模拟生理条件下(pH 7.40, 310 K)的紫外吸收光谱。 如图2所示, 在模拟的生理条件下, BSA的特征紫外最大吸收出现在280 nm附近, 该波长处吸光度随外源人参皂苷Rh2浓度增大(0~300 μ mol· L^-1)呈明显增加趋势, 且伴随一定程度的波长红移(~5 nm), 表明20S-和20R-Rh2均与BSA发生了显著的相互作用, 导致BSA上相关氨基酸残基疏水性增强。 进一步对比图2(a)和(b)发现, 两个差向异构体在引起BSA二级结构变化的量-效关系上存在明显差异。 对于BSA在280 nm附近的特征紫外吸收强度, 低浓度(< 100 μ mol· L^-1)的20S-Rh2几乎没有影响, 当达到中等浓度(100~300 μ mol· L^-1), 可见显著的增强效应, 且效应强度较等浓度的20R-Rh2大; 但随浓度进一步升高(> 300 μ mol· L^-1), 二者的作用强度发生反转, 20R-Rh2较等浓度20S-Rh2显示更大的增幅。

图2

Fig.2

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	图2 人参皂苷20S-Rh2 (a)和20R-Rh2 (b)对BSA紫外吸收光谱的影响Fig.2 The effects of ginsenoside 20S- (a) or 20R-Rh2 (b) on ultraviolet spectra of BSA cBSA=2.0× 10-6 mol· L-1, pH=7.40, T=310 K, ginsenoside Rh2 1→ 7: 0, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3 mmol· L-1

血清白蛋白的内源性荧光与分子中具有芳香共轭结构的氨基酸残基有关, 包括色氨酸(Trp)、 酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe), 以具有较高荧光量子产率的色氨酸残基为主^[15]。 如图3所示, 模拟生理条件下的BSA在342 nm附近有特征的荧光发射, 且荧光强度随外源人参皂苷Rh2浓度增大(0~400 μ mol· L^-1)呈明显减弱趋势, 同时伴随一定程度的波长蓝移, 进一步表明20S-和20R-Rh2均与BSA发生了显著的相互作用, 导致相关氨基酸残基周围微环境极性增强, 从而引起内源荧光猝灭和波长蓝移^[15]。 对比图3(a)和(b)发现, 两个差向异构体在引起BSA内源性荧光猝灭的量-效关系上同样存在显著性差异。 在试验浓度范围内, 20S-Rh2较20R-Rh2的荧光猝灭效应更强, 高浓度下(400 μ mol· L^-1)下可使BSA的荧光强度降低超过50%, 且蓝移程度更大(14 nm vs. 7 nm)。 结果表明, 20S-Rh2与BSA的相互作用程度可能较20R-Rh2更强。

图3

Fig.3

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	图3 人参皂苷20S-Rh2 (a)和21R-Rh2 (b)对BSA荧光发射光谱的影响Fig.3 The effects of ginsenoside 20S- (a) or 20R-Rh2 (b) on fluorescence emission spectra of BSA cBSA=2.0× 10-5 mol· L-1, λ ex=280 nm, λ em=342 nm; ginsenoside Rh2 1→ 7: 0, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 mmol· L-1

蛋白质分子中氨基酸残基的荧光发射与其所处环境的疏水性有关, 因此荧光光谱可以反映残基所处微环境的变化及其所引起的蛋白质构象的改变。 然而, 内源性Trp和Tyr的荧光光谱严重重叠, 常需采用选择性进一步改善的同步荧光光谱进行蛋白质构象研究。 同步荧光信号的观测结果受激发与发射波长差Δ λ 影响, Δ λ ≤ 15 nm和Δ λ ≥ 60 nm(斯托克斯位移)的同步荧光能够分别选择性地呈现Tyr和Trp的光谱特征^[14]。 因此, 针对BSA在模拟生理环境中的同步荧光光谱特征及人参皂苷Rh2的影响, 分别在Δ λ =15和60 nm条件下进行测定, 所得光谱如图4所示。 结果表明, 同步荧光光谱能够更为直观、 清晰地反映人参皂苷Rh2与BSA相互作用的立体选择性特征。

对比图4(a)和(b)发现, 尽管20S-和20R-Rh2对BSA同步荧光光谱的峰值位置均没有明显的影响, 但对峰值强度的影响有且明显不同。 在试验浓度范围内, 20S-Rh2对Δ λ =60 nm的BSA同步荧光光谱峰值强度几乎不产生影响, 但Δ λ =15 nm的同步荧光光谱峰值强度随浓度增加显著提高[图4(a)1], 表明其与BSA相互作用可能主要涉及对Tyr残基附近微环境的影响, 对Trp影响甚微; 随外源20R-Rh2浓度增大, 对两种BSA同步荧光光谱均会引起峰值强度提高, 且效应强度相近[图4(b)], 表明其可能同时影响BSA的Tyr和Trp残基附近微环境。

图4

Fig.4

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	图4 人参皂苷20S-Rh2 (a)和20R-Rh2 (b)对BSA同步荧光光谱的影响Fig.4 The effects of ginsenoside 20S- (a) or 20R-Rh2 (b) on synchronous fluorescence spectra of BSA cBSA 2.0× 10-5 mol· L-1; 1: Δ λ =15 nm, 2: Δ λ =60 nm; ginsenoside Rh2 1→ 6: 0, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.3 mmol· L-1

2.4.1 荧光猝灭机制

为进一步探讨人参皂苷Rh2对BSA的荧光猝灭作用机制, 针对不同猝灭剂浓度下的荧光光谱数据, 采用Stern-Volmer方程进行处理

F0/F=1+Kqτ0Cq=1+KSVCq(1)

其中, F₀和F分别为未加入和加入猝灭剂的体系荧光强度;

Cq为猝灭剂浓度; K_SV和K_q分别为猝灭常数和猝灭速率常数; τ ₀为不存在猝灭剂时生物大分子的内源性荧光寿命^[14]。 以各体系的(F₀-F)/F测量值对c_q进行直线拟合, 结果均呈良好线性关系[r> 0.999, 图5(a)]。 进一步根据直线斜率(K_SV)和BSA的荧光寿命τ ₀(~1.0× 10^-8 s), 计算得两个相互作用体系在模拟生理条件下的K_q值分别为3.7× 10¹²和2.8× 10¹² L· (mol· s)^-1, 远超过生物大分子的最大碰撞猝灭速率常数(2.0× 10¹⁰ L· (mol· s)^-1), 表明20S-Rh2和20R-Rh2对BSA的荧光猝灭过程均是通过形成复合物引起静态猝灭, 但20S-Rh2在猝灭速率常数上略高于20R-Rh2。

图5

Fig.5

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	图5 BSA与人参皂苷Rh2相互作用的Stem-Volmer图(a)和双对数曲线(b)Fig.5 Stem-Volmer plots (a) and double-log plots (b) for fluorescence quenching of BSA by ginsenoside Rh2 cBSA=2.0× 10-5 mol· L-1; λ ex=280 nm; λ em=342 nm

2.4.2 结合常数与结合位点数

对于静态猝灭体系, 在猝灭剂与复合物在测定波长内均不产生荧光的情况下, 若猝灭剂的量远超过荧光体的量, 可利用Mineweaver-Burk双倒数曲线方程, 计算这种结合类型下的结合常数K_a与结合位点数n^[14]

lgF0-FF=lgKa+nlgcq(2)

针对人参皂苷20S-Rh2和20R-Rh2对BSA荧光猝灭体系分别进行处理, 结果各体系拟合方程线性关系良好[r> 0.998, 图5(b)]。 根据线性方程截距和斜率, 计算得K_a和n值, 汇总见表1。 结果发现, 在模拟生理条件下, 20S-Rh2和20R-Rh2与BSA相互作用的n值均接近1, 表明二者均按1∶ 1摩尔比与BSA形成复合物; 两个体系的K_a值分别为2.5× 10⁴和1.0× 10⁴ L· mol^-1, 进一步证实两个差向异构体均能与BSA形成稳定的分子复合物。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 人参皂苷-Rh2与BSA作用的结合常数和结合位点数 Table 1 The binding constants and the number of binding sites for the interactions between BSA and ginsenoside Rh2 Ginsenoside Ksv/(× 104 L· mol-1) Kq/[× 1012 L· (mol· s)-1] Ka/(× 104 L· mol-1) n 20S-Rh2 3.7 3.7 2.5 0.96 20R-Rh2 2.8 2.8 1.0 0.90

表1 人参皂苷-Rh2与BSA作用的结合常数和结合位点数 Table 1 The binding constants and the number of binding sites for the interactions between BSA and ginsenoside Rh2

图6

Fig.6

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	图6 HSA与人参皂苷Rh2的结合模式图Fig.6 Binding mode diagrams between HSA and ginsenoside Rh2 (a): Full view; (b): Ligand interaction diagram

2.4.3 分子对接分析

分子对接是虚拟筛选研究的关键过程, 有助于获得功能蛋白质与小分子配体间相互作用的详细信息^[16]。 在光谱实验研究的基础上, 进一步利用分子对接技术, 探索分析血清白蛋白与人参皂苷Rh2相互作用的立体选择性机制, 为充分模拟人体生理环境, 以人血清白蛋白(HSA, PDB ID: 4IW1)作为分子对接研究靶蛋白。 HSA由585个氨基酸残基组成三个同源结构域, 分别包含A和B两个亚域, 并经17个二硫键高度交联成心形的α -螺旋状分子, 在结构和功能上均与BSA高度一致, 小分子配体常结合在Ⅰ 和Ⅱ 两个结构域上^{[18, 22]}。

如图6(a)所示, 对接结果表明, 人参皂苷Rh2差向异构体与HSA相互作用的结合区域存在明显差异, 其中, 20S-Rh2结合在HSA的Ⅰ B和Ⅱ B结构域上, 而20R-Rh2则结

合在Ⅰ B和Ⅲ B上。 二者与HSA的分子对接得分分别为-4.51和-3.82总结合自由能Δ G_bind分别为73.17和69.97 kJ· mol^-1, 均为负值, 表明均能与HSA自发形成具有一定热力学稳定性的分子复合物, 但20S-Rh2较20R-Rh2具有更大的结合自由能绝对值, 显示相互作用程度更强, 与上述根据静态猝灭机制计算所得二者在结合常数K_a上的差异一致, 进一步证实20S-Rh2和20R-Rh2均能与血清白蛋白形成相对稳定的复合物, 但结合程度有所不同。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 HSA与人参皂苷-Rh2的主要相互作用力和氨基酸残基 Table 2 Docking results of the main force and vital residues involved in interaction by HSA and ginsenoside Rh2 Interaction force 20S-Rh2 20R-Rh2 H-bond Lys195 Asn295 His288 Glu184 Hydrophobic Phe211 Trp214 Ala215 Leu219 Phe156 Ala191 Trp214 Val343 Leu238 Ala291 Pro339 Val343 Pro447 Cys448 Tyr452 Pro441 Ala443 Pro447 Cys448 Electrostatic Arg218 Arg222 Glu292 Arg160 Lys195 Glu188 Arg218 Glu294 Asp340 Lys444 Ash451 Arg222 Glu292 Lys436 Ash451

表2 HSA与人参皂苷-Rh2的主要相互作用力和氨基酸残基 Table 2 Docking results of the main force and vital residues involved in interaction by HSA and ginsenoside Rh2

针对HSA与人参皂苷Rh2相互作用模式的对接分析结果如图6(b)所示, 相互作用力和所涉主要氨基酸残基汇总见表2。 结果表明, 人参皂苷Rh2与HSA间存在氢键、 疏水作用力及静电引力、 范德华力等其他相互作用, 主要通过氢键和疏水作用力锚定在蛋白上, 且关键结合位点在蛋白分子的生色团附近, 因而可能通过相互作用引起内源性荧光猝灭, 从机制上为上述BSA体系的荧光猝灭提供了解释。 然而, 尽管20S-和20R-Rh2均与HSA形成两个氢键, 但C-20立体化学导致二者在结合域上的差异, 参与氢键相互作用的基团和结合方式也完全不同。 20S-Rh2经糖上的C_6’ -OH和侧链的C₂₀-OH分别接受氨基酸残基Lys195, Asn295的活泼H形成氢键(2.68, 2.21 Å ), 20R-Rh2则由糖上C_2’ -OH和C_6’ -OH分别提供活泼H与蛋白的Glu184和His288进行氢键结合(1.67, 1.98 Å )。 立体选择性同样表现在疏水相互作用上。 相比于20R-Rh2, HSA与20S-Rh2的结合涉及更多的氨基酸残基, 导致更稳定的结合, 因而结合自由能和结合常数相对更大(-73.17 vs. -69.97 kJ· mol^-1; 2.5× 10⁴vs. 1.0× 10⁴ L· mol^-1)。 另一方面, 在HSA与20R-Rh2的疏水相互作用中同时涉及有Trp和Tyr, 对于20S-Rh2, 则仅有Trp参与, 结果导致二者对蛋白同步荧光光谱的影响存在差异。 分子对接进一步解释并验证了上述光谱分析的实验研究结果。