蓝细菌是一类能通过光合作用获取能量的细菌, 它含有菌绿素, β -胡萝卜素和藻胆蛋白, 其中藻胆蛋白能被藻类吸收是一种传递光能的天然色素。 近年来, 为研究蓝细菌, 国内学者提出了液相色谱-质谱联用、 流式细胞术以及荧光显微镜等方法^[1], 但是液相色谱-质谱联用方法会破坏细胞结构, 不利于活细胞分选, 而荧光显微镜则不适合做大数量检测。

因此, 本文利用流式细胞术对蓝细菌进行荧光标记并检测, 传统流式细胞仪使用滤光片对细胞经过激光探测区所产生的光信号按不同波段进行分光, 通过光电倍增管(PMT)或雪崩光电二极管(APD)对每个通道的光信号进行检测。 在细胞的多色分析中, 由于荧光基团发射光谱较宽, 多种染料或蛋白质同时受激发导致光谱重叠, 带来严重的串色问题, 使得光检测器测量的信号强度和目标荧光染料的真实强度之间存在差异, 因此, 需要进行繁琐的荧光补偿^{[2, 3]}。 但是荧光补偿不仅计算繁琐, 而且容易产生补偿过度或不足, 大大增加了实验的复杂程度^[4]。

为了克服传统流式细胞术检测参数的限制, 光谱流式细胞技术应运而生, 光谱流式技术是在传统型流式细胞术的基础上, 利用光栅或棱镜代替滤光片对单个细胞经过激光探测区所发出的荧光进行分光, 使用阵列检测器对细胞的全光谱进行采集的新一代流式细胞检测手段, 其通过荧光光谱去卷积分析, 可以较轻松地实现细胞的多色同时检测^{[5, 6, 7]}。 在化学分析中, 多元分辨曲线是经常用到的数据处理工具; 它不需要事先知道基本化学模型, 就能够建立模型来描述假设中的化学模型, 从混合物演进过程的数据中解析出纯物质的性质^{[8, 9]}(如光谱曲线, pH曲线等)。 针对分析蓝细菌流式荧光光谱实验, 本文利用主成分分析(principal component analysis, PCA)以及多元曲线分辨方法中渐进因子分析(evolving factor analysis, EFA)与交替最小二乘(alternating least square, ALS)相结合的方法对模拟仿真蓝细菌荧光光谱的分解进行了详细的比较和分析, 并在实际蓝细菌WH7805实验分析中得出纯光谱组分以及组分浓度。

流式细胞仪测到的光谱矩阵D满足

D=CST+E(1)

式(1)中, 光谱矩阵D和误差矩阵E的维数为N_C× N_S, 浓度矩阵C的维数为N_C× N, 纯光谱S^T矩阵的维数为N× N_S。 其中N_C是光谱曲线数(即所测细胞数), N_S是波长点数, N是组分数。

本文利用主成分分析、 渐进因子分析得到蓝细菌纯光谱的组分数以及纯光谱的初始估计, 将其作为交替最小二乘法的初始值, 结合光谱的单峰性及非负性对蓝细菌荧光光谱数据进行迭代处理, 得出蓝细菌含有的荧光组分并估计每种荧光组分的浓度。

1.3 ALS交替最小二乘法

交替最小二乘法利用EFA近似估计纯光谱矩阵对测量数据进行反复迭代运算, 直到混合光谱的均方误差MSE满足MSE≤ ζ 或者迭代次数达到设定值M, 从而求得纯光谱和组分浓度。 其中均方误差MSE定义为

MSE=∑i=1NC∑j=1NSEij2NC×NS(4)

图1

Fig.1

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图1 蓝细菌流式荧光光谱分析方法算法流程图Fig.1 Algorithm flowchart of flow cytometer data analysis

计算步骤如下:

(1) 将纯光谱估计S^T进行非负、 单峰性、 归一化处理, 并对其起始与终止位置进行牛顿三次插值修正后代入式(5)中;

C=D(ST)-1(5)

(2) 根据式(6)估计混合光谱 D˙;

D˙=CST(6)

(3) 根据式(7)计算混合光谱误差矩阵E

E=D-D˙(7)

(4) 若均方误差小于等于迭代阈值或者迭代次数大于设定值M, 则判断S^T为混合光谱的纯组分, C为组分浓度并结束运算, 否则继续运算;

(5) 将得到的浓度矩阵C代入式(8)中, 返回步骤(1)。

ST=C-1D(8)

利用已知六种荧光染料的发射光谱数据(FITC, QD545, PE, QD605, AF610-PE, PerCP等), 根据式(1)模拟仿真产生1 000个细胞的光谱数据D。 其中, 纯组分光谱的波长范围在450~750 nm, 归一化最大谱峰强度为100。

当仿真的荧光光谱只有3种组分时, 采用本算法得到的纯光谱图与理想仿真纯光谱基本重合, 谱线形状也基本重合, 识别的谱峰位置准确, 能够得到准确的光谱波长起始点和终止点, 从而得出较为准确的组分浓度。 图2为三种组分的仿真光谱及其处理结果。

图2

Fig.2

Figure Option ViewDownloadNew Window

图2 三种组分混合光谱解析结果 (a): 三种组分1 000个仿真混合光谱图; (b): 三种组分第561个细胞的荧光光谱对比图; (c): 三种组分的纯光谱对比图; (d): 三种组分第561个细胞的组分浓度估计对比图Fig.2 Estimated results of the mixed spectra with three components (a): Three components 1 000 cells simulated mix fluorescence spectra; (b): Comparison between the 561st cell fluorescence spectra and signal after processed with three components; (c): Comparison between the simulated pure components and estimated ones from three components; (d): Comparison of the 561st cell concentration estimation with three components

为研究本方法对混合光谱解析的适用性, 逐渐增加仿真光谱中的纯组分数(6种, 10种, 12种)。 由于纯光谱并不都满足EFA的“ 先进先出” 原则, 所以需要选择合适的纯组分起始和终止位置, 对纯光谱进行浓度修正; 结合图3, 图4及表1可以看出, 虽然总体上都能够拟合出较好的混合光谱波形, 但是随着纯组分数的增多, 对纯组分光谱的估计会出现一定的偏差。 该偏差一方面取决于纯组分的数目, 另一方面还取决于纯组分的重合程度。 从表1中可以看出, 组分数由6增加到8和10时, 其拟合效果下降较多。 因此, 在300 nm的范围内, 当纯组分光谱数量小于6时, 得到的纯光谱及浓度矩阵还是较为准确可靠的。

图3

Fig.3

Figure Option ViewDownloadNew Window

图3 六种组分混合光谱解析结果 (a): 六种组分1 000个仿真混合光谱图; (b): 六种组分第561个细胞的荧光光谱对比图; (c): 六种组分的纯光谱对比图; (d): 六种组分第561个细胞的组分浓度估计对比图Fig.3 Estimated results of the mixed spectra with six components (a): Six components 1 000 cells simulated mix fluorescence spectra; (b): Comparison between the 561st cell fluorescence spectra and signal after processed with six components; (c): Comparison between the simulated pure components and estimated ones with six components; (d): Comparison of the 561st cell concentration estimation with six components

图4

Fig.4

Figure Option ViewDownloadNew Window

图4 10种组分混合光谱解析结果 (a): 10种组分1 000个仿真混合光谱图; (b): 10种组分第561个细胞的荧光光谱对比图; (c): 10种组分的纯光谱对比图; (d): 10种组分第561个细胞的组分浓度估计Fig.4 Estimated result of the mixed spectra with ten components (a): Ten components 1 000 cells simulated mix fluorescence spectra; (b): Comparison between the 561st cell fluorescence spectra and signal after processed withten components; (c): Comparison between the simulated pure components and estimated ones with ten components; (d): Comparison of the 561st cellconcentration estimation with ten components

本文实验仪器是厦门大学化学化工学院自主开发的光谱流式细胞仪, 其能有效同时测量纳米颗粒和生物分子的荧光和散射光, 实现颗粒计数和获取颗粒的生物性质及其体积、 浓度特性^{[10, 11]}; 实验对象是蓝藻细菌WH7805。

由于实验设备和实验环境的影响使得测到的原始光谱曲线存在毛刺, 显然噪声的存在会影响算法的结果分析, 所以本文用滑动平均值法对原始数据进行了预处理, 处理后的结果如图5(a)所示。 根据目前的研究结果, 已知蓝细菌WH7805含有APC和PE两种组分。 首先假设组分完全未知, 对实验数据进行处理; 然后在已知两种组分的条件下, 再次对实验数据进行分析, 并比较两种情况下的处理结果。

根据主成分分析, 当选取组分数为6时达到特征值累计贡献率为99.96%, 因此选择6种组分纯光谱来拟合混合荧光光谱。 在纯组分完全未知的前提下, 得到如图5(b)的纯组分估计。 图5(d)和(c)为第561个细胞的拟合光谱及其浓度估计。

表1

Tabel 1

表1(Tabel 1)

表1 不同数目纯组分估计结果的均方误差 Tabel 1 MSE of estimated results for different numbers of components Number of components MSE 3 1.279 8 4 3.408 9 6 5.976 4 8 11.039 3 10 32.946 2 12 33.237 8

表1 不同数目纯组分估计结果的均方误差 Tabel 1 MSE of estimated results for different numbers of components

在已知两种组分前提下, 将图5(b)中峰位置与APC和PE最接近的组分1和6替换为APC和PE的纯光谱, 处理得到如图5(e)的纯光谱, 获得的拟合光谱及其浓度如图5(g)和(f)所示。

分析图5(d)和图5(g), 可以看出拟合的混合光谱还是能比较好的模拟实际蓝细菌光谱, 谱线平滑, 识别的谱峰位置准确。 但是由于实际蓝细菌组分的复杂度比仿真光谱大得多, 利用EFA得到的纯组分只是估计主要几种纯组分, 因此拟合光谱与实际光谱的形状不能完全的重合。 另外, 无论是否已知两种纯组分, 其对混合光谱的拟合效果接近, 但是对于纯组分光谱和浓度的估计则略有不同。 这说明, 对于相同的混合光谱, 存在多组可能的解析结果, 因此两种组分已知的解析结果相对更可靠。

图5

Fig.5

Figure Option ViewDownloadNew Window

图5 蓝细菌WH7805荧光光谱解析结果 (a): 蓝细菌WH7805荧光光谱; (b): 在组分完全未知情况下估计的纯组分光谱; (c): 在组分完全未知情况下第561个蓝细菌的纯光谱组分浓度; (d): 在组分完全未知情况下第561个蓝细菌混合荧光光谱对比图; (e): 在组分部分已知情况下估计的纯组分光谱; (f): 在组分部分已知情况下第561个蓝细菌的纯光谱组分浓度; (g): 在组分部分已知情况下第561个蓝细菌混合荧光光谱对比图Fig.5 Estimated results of cyanobacteria WH7805 mixed spectra (a): WH7805 cells mix fluorescence spectra; (b): The estimated result of pure components with components completely unknown; (c): Concentration estimation of the 561st cell with components completely unknown; (d): Comparison between the 561st cell fluorescence spectra and estimated signal with components completely unknown; (e): The estimated result of pure components with components partly known; (f): Concentration estimation of the 561st cell with components partly known; (g): Comparison between the 561st cell fluorescence spectra and estimated signal with components partly known

基于主成分分析、 渐进因子分析及交替最小二乘法对蓝细菌流式荧光光谱进行解析, 该方法先利用主成分分析得到蓝细菌的纯组分数量; 再通过渐进因子分析得到各组分的起始位置和终止位置并估计纯光谱的初始波形; 然后利用交替最小二乘对纯光谱和浓度矩阵进行迭代估计, 并在处理过程中加入了非负性、 归一化、 单峰性等约束条件; 最后, 通过设定阈值获得较为准确的纯光谱和浓度矩阵。 在仿真实验中, 通过对不同组分数的混合光谱进行处理, 结果表明本文方法能够得到较为准确的谱峰位置、 纯组分光谱以及浓度估计。 在实验中, 将本方法应用于蓝细菌流式荧光光谱处理, 能够较好地估计纯组分光谱及其组分浓度, 获得较为理想的拟合光谱, 可供蓝细菌后续生化研究使用。