盐酸吡格列酮购于国药集团化学试剂有限公司。 氯金酸(HAuCl₄· 3H₂O, 99.99%)及柠檬酸钠(99%)购于阿法埃莎(中国)化学有限公司。 实验中所用的水均为超纯水(> 18.2 MΩ · cm, 3 ppb)。

超纯水仪(Heal-force, smart-N系列), 便携式拉曼光谱仪(B& W TekOpto-Electronics, 激发光波长785 nm, 激光功率为500 mW, 积分时间为500 ms), 高速离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.3.1 金纳米粒子的合成

首先将200 mL浓度为0.01 Wt%的氯金酸溶液煮沸。 然后往里面一次性快速地加入1.5 mL柠檬酸钠溶液(浓度为1 Wt%), 约3 min左右溶液变为红棕色, 之后保持煮沸30 min, 然后冷却待用。

图1分别为用柠檬酸钠法合成制备的金溶胶的扫描电镜图和紫外-可见吸收光谱图。 由图可知, 金纳米粒子呈球形, 且十分均匀, 直径约55 nm。 同时, 在550 nm处可观察到一明显的特征吸收峰。 这也进一步表明通过该方法可成功实现Au纳米溶胶的合成。

图1

Fig.1

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	图1 55 nm金纳米粒子的扫描电镜图(a) 和紫外可见吸收光谱图(b)Fig.1 (a) SEM image and (b) UV-Vis spectrum of 55 nm Au NPs

图2为用便携拉曼光谱仪快速检测盐酸吡格列酮的示意图。 测试时, 首先将待测样品与Au纳米溶胶充分混合, 使待测分子吸附于Au纳米溶胶表面, 然后直接利用便携式拉曼光谱仪测试。 测试结果如图3所示。 由图可知, 对于固体纯样品, 利用普通拉曼光谱, 便可以观测到一系列盐酸吡格列酮的特征拉曼谱峰。 然而, 对于100 μ g· L^-1的盐酸吡格列酮标准溶液, 则无法获得相应的拉曼信号。 这是因为普通拉曼光谱灵敏度较低, 无法实现痕量样品的检测。

图2

Fig.2

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	图2 便携式拉曼光谱仪快速检测盐酸吡格列酮示意图Fig.2 The schematic diagram of rapid detection for pioglitazone hydrochloridebya portable Raman spectrometer

为了获得低浓度下盐酸吡格列酮的拉曼信号, 本研究中进一步采用表面增强拉曼光谱对盐酸吡格列酮开展研究。 为了排除金溶胶表面杂质对拉曼信号的干扰, 同样取100 μ L盐酸溶液(1 mol· L^-1)加入500 μ L纳米金溶胶并进行采谱, 得到金溶胶自身的表面增强拉曼信号(图3黑色曲线)。 由图可知, 对于金溶胶本身, 基本观察不到拉曼信号或者说对我们的实验基本没有影响。 这是因为, 本研究中采用的柠檬酸钠为弱保护剂, 因此在金溶胶表面的覆盖度很低, 故对后续实验的干扰较小。

图3

Fig.3

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	图3 盐酸吡格列酮的分子结构式(a)及其 普通拉曼光谱与增强拉曼光谱分析(b) Fig.3 (a) The molecular structure of pioditazone hydrochloride and (b) its normal Raman spectrum as well as surface-enhanced Raman spectrum

图3中红色曲线为盐酸吡格列酮标准溶液(100 μ g· L^-1)的表面增强拉曼光谱图。 可以发现, 在600, 820, 860, 1 002, 1 177, 1 204, 1 307, 1 501和1 591 cm^-1处可观察到一系列拉曼谱峰。 对比盐酸吡格列酮固体粉末及金溶胶的拉曼光谱图可知, 这些峰可归属为盐酸吡格列酮的特征谱峰。 其中1 177和1 204 cm^-1可能为对位二取代苯的骨架振动峰, 1 501 cm^-1为苯衍生物的环伸缩峰, 1 591 cm^-1处的拉曼谱峰可归属于盐酸吡格列酮中苯环碳碳键伸缩振动^[14]。 进一步比较还可发现, 这些峰相对固体盐酸吡格列酮的普通拉曼峰发生明显位移, 且相对强度发生变化。 这表明盐酸吡格列酮吸附于Au纳米溶胶表面, 并与Au发生电子作用, 从而导致其化学键强度发生改变。 其中, 1 591 cm^-1处的拉曼特征峰不仅信号较强, 且不与其他谱峰重叠, 因此非常适合用于后续定量检测分析。

为了研究表明增强拉曼光谱在盐酸吡格列酮定量分析中的可行性, 我们进一步对不同浓度盐酸吡格列酮的标准溶液进行了测试。 首先进行盐酸吡格列酮的标准溶液的配制, 取0.1 g的盐酸吡格列酮于100 mL的容量瓶中, 加入1 mol· L^-1盐酸, 定容至标线, 得到1 g· L^-1的盐酸吡格列酮标准溶液。 用1 mol· L^-1 的盐酸溶液将上述标准溶液稀释, 分别配制130, 100, 70, 40, 10, 和0 μ g· L^-1的盐酸吡格列酮标准溶液。 取100 μ L配制好的盐酸吡格列酮标准液, 加入500 μ L的纳米金溶胶, 混匀, 直接利用便携式拉曼光谱仪采集谱图, 便可得到盐酸吡格列酮的表面增强拉曼光谱图, 结果如图4(a)所示。 由图可知, 随着盐酸吡格列酮浓度的降低, 其拉曼特征峰也在不断减弱。 当浓度为10 μ g· L^-1时, 仍然可明显观察到盐酸吡格列酮的特征拉曼谱峰。 这说明表明增强拉曼光谱在盐酸吡格列酮分析中具有很高的灵敏度, 最低检测浓度可达10 μ g· L^-1。

同时利用盐酸吡格列酮中苯环碳碳键伸缩振动特征峰(1 591 cm^-1)的强度, 我们还对盐酸吡格列酮进行了定量分析。 如图4b所示, 在10~130 μ g· L^-1范围内, 盐酸吡格列酮浓度与其拉曼强度具有良好的线性关系, 相关系数为0.992 3。 这表明该方法不仅灵敏度高, 而且适用于盐酸吡格列酮的定量分析。

图4

Fig.4

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	图4 不同浓度盐酸吡格列酮的表面增强拉曼光谱图(a)及其浓度与特征峰(1 591 cm-1)强度间的关系(b) 2.4 唾液中的盐酸吡格列酮含量分析Fig.4 (a) SERS spectra of pioditazone hydrochloride solution with different concentrations; (b) The relationship between the pioditazone hydrochloride concentration and the Raman intensity of the peak at 1 591 cm-1

为了利用上述表面增强拉曼光谱方法检测唾液中盐酸吡格列酮的含量, 首先对唾液进行了简单的前处理。 取待测唾液样品1 mL加入2 mL的乙酸乙酯, 强烈振荡2 min; 在离心机上以4 000 r· min^-1离心5 min, 取1 mL的上清液; 65 ℃下利用氮气或空气吹干后, 加入0.5 mL 1 mol· L^-1的盐酸溶液强烈振荡2 min复溶, 得到待测液。 往待测液中加入500 μ L的纳米金溶胶, 混匀, 利用便携式拉曼光谱仪对待测液进行测试。 我们首先对空白唾液进行了分析, 如图5所示(黑色曲线), 未观察到明显的拉曼谱峰。 这表明唾液中的其他成分对分析不会带来干扰。 然后, 我们对含有盐酸吡格列酮的唾液经过同样的前处理后, 直接用常规拉曼对其进行检测, 如图5所示的蓝色曲线, 同样未观察到明显的拉曼特征峰, 这表明唾液中盐酸吡格列酮的含量很低, 用常规拉曼无法进行检测。 然后对含有盐酸吡格列酮的唾液, 用增强拉曼来进行检测则可明显观察到盐酸吡格列酮的特征拉曼谱峰, 且峰型与强度同标准样品基本一致。 结合上述标准曲线, 还可进一步计算得到该唾液中盐酸吡格列酮的含量为96.8 μ g· L^-1。 上述实验结果表明, 结合便携式拉曼光谱仪, 利用本研究建立的表面增强拉曼光谱方法可对唾液中盐酸吡格列酮的含量进行快速、 定量检测。 该方法灵敏度高、 操作简便, 可广泛地应用在临床的药物控制中。

图5

Fig.5

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	图5 唾液中盐酸吡格列酮的表面增强拉曼光谱分析Fig.5 SERS spectra of pioditazone hydrochloride in human saliva