Cary eclipse荧光分光光度计(美国Varian公司)UV-2600紫外-可见分光光度计(日本Shimazu公司); F-7000荧光分光光度计(日本Hitachi公司); FLS920荧光光谱仪(英国Edinburgh Instruments); TECNAI G2 Spirit TWIN 场发射透射电子显微镜(美国FEI公司); HPLC-6500Q-TOF液质联用仪(美国Agilent公司); ZetaPALS Zeta电位及粒径分析仪(美国布鲁克海文仪器公司)L-胱氨酸(Mr=240.3, AR, 阿拉丁试剂); 胱氨酸片(山西云鹏制药有限公司H14023927) : 规格为50 mg· 片^-1; 其余的试剂均为分析纯; 试验所用的水为二次蒸馏水。

1.2.1 荧光性胱氨酸聚集纳米团簇FANC的制备

用电子天平称取0.240 3 g的L-胱氨酸, 用适量的氢氧化钠溶解, 调节pH 9.0, 并用蒸馏水定容至100 mL的容量瓶中, 配制成0.01 mol· L^-1的溶液, 于90 ℃恒温水浴加热12 h后, 制得荧光性FANC样品溶液, 临用前根据需要用pH 8.90的Tris-HCl缓冲溶液将储备液进行透析处理并稀释配制为操作液。

1.2.2 FANC溶液的荧光光谱和荧光寿命曲线的测定

采用500Da透析袋将FANC溶液透析2天, 去除胱氨酸原料后, 于F-7000荧光分光光度计上测量荧光光谱。 设置各项荧光光谱测量参数如下: 激发波长=410 nm; 狭缝比为5.0 nm/5.0 nm; 发射光谱波长范围: 420~700 nm; 扫描速度为1 200 nm· min^-1。

在FLS920型稳态/瞬态荧光光谱仪测试荧光量子产率和荧光寿命曲线, 采用nF920纳秒灯为激发光源, 基于非线性最小二乘函数, 使用双指数函数对荧光寿命的曲线进行拟合, 拟合公式如下^[13]

Y(t)=A1exp(-t/τ1)+A2exp(-t/τ2)

荧光寿命平均值的计算方法如下

τaverage=A1τ12+A2τ22A1τ1+A2τ2

式中: Y(t)是指时间为t时的荧光强度; A₁和A₂分别为第1和2个过程的时间分辨衰减权重; τ ₁, τ ₂和τ _average分别为第1和2个过程和平均荧光寿命。

1.2.3 FANC溶液的荧光机理探讨

采用500Da透析袋将FANC溶液透析一周纯化后, 采用场发射透射电子显微镜表征团簇形貌, 加速电压为40~120 kV, 放大倍率为50~500。 采用Zeta电位及粒度分析仪表征团簇表面电荷状态和水合粒径的大小, 采用He-Ne激光器激发。 通过四极杆-飞行时间串联质谱仪测定质谱图, 采用ESI离子源; 离子传输管温度: 25 ℃; 扫描模式: 正离子模式; 扫描范围: 100~1 500。

1.2.4 FANC溶液的荧光性质实验

通过以下方法考察FANC分子聚集体溶液的各种荧光性能:

(1)抗盐性能: 准确移取1 mL FANC溶液至10 mL比色管中, 加入5 mL pH 8.90的Tris-HCl缓冲溶液, 再分别加入不同浓度的氯化钠溶液, 定容摇匀后测定其荧光光谱, 考察体系荧光受不同盐浓度环境影响的情况。

(2)pH值的影响: 准确移取1 mL FANC溶液至10 mL比色管中, 再加入不同pH值的BR缓冲溶液各9 mL, 混合均匀后测定其荧光光谱, 考察pH值对体系荧光强度的影响。

(3)抗光漂白性: 准确移取制备的FANC溶液置于410 nm光源下照射, 每隔一定的时间测其荧光光谱, 考察体系的荧光强度受光源辐射的变化情况。

(4)波长依赖性: 选择间隔10 nm激发波长从350 nm变化至450 nm考察FANC的荧光发射光谱受激发波长的影响情况。

1.2.5 胱氨酸片样品的含量分析

准确移取市售胱氨酸片20片, 用研钵研细, 用电子天平准确称取0.1 g, 加5 mL pH 8.90的Tris-HCl缓冲溶液, 超声溶解后定容至10 mL。 用0.22 μ m微滤膜过滤, 取1 mL滤液稀释10倍, 于90 ℃温度下水浴加热12 h后, 制成样品溶液。 于荧光分光光度计上测绘荧光光谱, 同时用二次水进行空白对照实验。

按实验方法, 将碱性胱氨酸溶液分别在不同水浴温度条件下加热相同时间, 考察最佳加热温度对FANC的影响, 实验结果如图1(a)所示。 当加热温度为90 ℃时, 体系的荧光强度最高, 所以本实验选加热温度为90 ℃作为最佳加热温度。 同样对加热时间和原料溶液的pH条件进行优化, 结果如图1(b)所示, 随着加热时间的增加, 溶液的荧光强度逐渐增强, 至12 h以上变化趋势趋于平缓, 考虑到反应效率问题, 选择12 h为最佳反应时间。

图1

Fig.1

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图1 热处理的温度(a)、 时间(b)和溶液pH(c)对形成FANC荧光强度的影响Fig.1 The fluorescent intensity of FANC solution affected by different thermal temperature (a), time (b) and pH (c)

按实验方法中的步骤, 用氢氧化钠和盐酸调节胱氨酸溶液的pH, 水浴加热反应后测定荧光光谱, 实验结果如图1(c)所示, 胱氨酸在中性和酸性条件下溶解性差, 无法形成分子聚集体, 几乎不形成发光体, 当pH值大于7以上, 胱氨酸分子呈去质子化状态, 易形成FANC而导致荧光强度随溶液碱性的增加而增强, 当pH为9时荧光强度最高, 这刚好符合胱氨酸在Cys-Cys^2-状态下的pKa电离常数, 当pH大于10以上, 过碱的条件下氨基的氢键作用受影响导致体系荧光强度反而下降。 因此, 选择pH 9.0的胱氨酸溶液为最佳反应溶液。

在FANC溶液的提纯实验过程中, 发现透析袋内外溶液都会发出荧光, 这意味着FANC团簇可能很小且单独存在。 通过透射电镜表征其形貌, 结果如图2(a)所示, 其粒径大小从5~45 nm呈不均匀分布。 对应的正离子质谱结果如图2(b), 经过90℃加热处理, 质谱图中所出现的峰的个数多且分布较广。 L-胱氨酸的相对分子质量为240.3, 质谱图中出现了一组m/z=121.05处的峰, 是胱氨酸沿着双巯基断裂而形成, 另外一组m/z=463.30处的峰, 我们推测是胱氨酸分子在水溶液中, 因团聚而成的二聚体分子后脱去了1分子水形成了分子聚集体; 质谱图中甚至还出现m/z=685.43和m/z=702.42的峰, 而这正好是3个胱氨酸分子脱去2分子水和一分子水形成的。 这都说明形成FANC分子簇的过程可能是胱氨酸小分子在碱性pH 9形成的Cys-Cys^2-分子结构中, 质子化的氨基和去质子的羟基之间以化学相互作用力聚集形成超分子结构。 而且质谱图上有更为复杂的新峰出现(m/z=507.33, 551.35和609.13等), 荷质比均较大, 应该是形成了分子团簇新结构, 由它们来加速荧光中心的形成, 进而产生荧光现象。

图2

Fig.2

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图2 FANC溶液的TEM (a), ESI-MS (b), zeta potential (c)和DLS curve (d)谱图Fig.2 TEM (a) image, ESI-MS spectrum (positive-ion mode) (b), the zeta potential (c) and DLS curve (d) of FANC solution. The scale bar is 200 nm; inset is size distribution of the FANC solution dialyzed for two days with 1000 KDa dialysis membrane

为了进一步说明其聚集体的表面状态, 通过测定其zeta电位和水合粒径, 结果如图2(c)和(d)所示, 其zeta电位值为-51.3 mV, 在水溶液中可以稳定存在, 结合水分子后形成水合粒径约为151 nm, 说明团簇表面基团呈亲水离子状态。

按实验方法准确移取FANC溶液, 于光谱仪上测绘紫外光谱和荧光光谱, 结果如图3(a)所示。 FANC的最大紫外吸收光谱峰位置出现在285 nm, 其荧光激发光谱在410 nm有一激发峰, 同时荧光发射光谱在508 nm处有最大的荧光发射峰, 荧光发射光谱和激发光谱呈镜像对称的关系。 对应的体系的荧光量子产率为8.48%。 为了分析FANC的荧光发射状态, 对其水溶液进行荧光寿命的测定, 实验得到两个荧光寿命值分别为1.813 5和6.761 3 ns, 图3(b)显示的是其寿命衰减曲线。 这说明该纳米团簇可能具有两个荧光发射中心。 采用双指数方程拟合得平均荧光寿命为6.028 5 ns, 与其他含氮有机本质荧光寿命值相近^{[9, 10, 11]}, 此结果进一步证明FANC荧光发射应归属于含氮分子聚集而形成的本质荧光。

图3

Fig.3

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	图3 FANC溶液的荧光光谱(a)和荧光寿命谱图(b)Fig.3 Fluorescence and absorption spectra (a) and decay curve (b) of 0.01 mol· L-1 cystine solution in pH 8.90 after heating (inset is photographs of FANC solution under visible and UV light)

按实验方法, 考察FANC溶液的光谱性能, 实验结果如图4所示, 结果表明FANC水溶液在加入NaCl溶液后和连续紫外光照射下, 其荧光光谱几乎不变, 表现出稳定的光谱性能。 考察FANC体系受pH环境的影响, 其荧光发射峰位置在较宽pH为3~11范围内很稳定, 而荧光强度随着pH的增加逐渐增大, 在pH为5~11范围内也趋于稳定。 当溶液的pH 12以上, 荧光强度急剧升高且发射峰位置也随之红移, 这可能是纳米团簇因碱性太强而发生解离导致的。 因此测定样品的过程选择在pH 8.90的Tris-HCl缓冲溶液中进行。

图4

Fig.4

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	图4 不同pH的FANC溶液的荧光发射光谱(a)及其发射峰位置(b)和荧光强度(c)随pH的变化趋势图Fig.4 (a) The emission spectra of the FANC at different pH B-R buffer solution; The relationship of emission wavelength (b) and fluorescent intensity (c) with different pH, slit=5.0 nm/5.0 nm

采用不同激发波长对FANC进行发射光谱扫描, 结果如图5所示, 在不同激发下FANC的荧光发射光谱的最大发射峰位置没有明显改变, 但是荧光强度先增后降, 在最佳激发为410 nm时达到最高。 这种激发光谱不依赖性质和荧光分子低温聚集发光的特性是一致的, 而不同于高温制备的碳核碳点表面态发光, 这也进一步验证FANC是分子聚集体的发光机理^{[14, 15]}。

图5

Fig.5

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	图5 不同激发光波长下的FANC的荧光发射光谱(a)及其发射峰位置(b)和荧光强度(c)随激发波长的变化趋势图Fig.5 (a) The emission spectra of the FANC solution at different excitation wavelengths; The relationship of fluorescent intensity (b) and emission wavelength (c) with excitation wavelength, slit=5.0 nm/5.0 nm

准确移取胱氨酸标准溶液配制一系列不同浓度的胱氨酸溶液, 按照最优化反应条件制备FANC溶液, 于荧光分光光度计上测定荧光强度。 结果如图6所示。 由图可知FANC体系的荧光强度在1× 10^-5~6× 10^-4 mol· L^-1范围内随着胱氨酸原料浓度的增加而增强, 线性方程为: Y=1 290+7.446× 10⁶c(mol· L^-1), 相关系数r=0.984 9。 检出限QL=4.559× 10^-9 mol· L^-1(3S₀/K), K为工作曲线的斜率, 10次空白试验的RSD值为1.08%。

图6

Fig.6

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	图6 胱氨酸标准溶液的工作曲线Fig.6 Fluorescence spectra of FANC with different Cystine concentration

实际样品中胱氨酸片剂制备过程中通常要加入大量辅料, 为了将本方法应用于测定实际样品, 当胱氨酸浓度为3.0× 10^-4 mol· L^-1时, 按实验方法对多种共存物质进行干扰实验。 当相对误差≤ ± 5%时, 以下共存物质允许倍数为500倍的有C O3-, N O3-, Cl^-, K⁺, N⁺; 允许倍数为100倍的是: Mg²⁺, Ca²⁺, Zn²⁺, 淀粉, 糊精; 允许倍数为50倍的有: 乳糖、 聚乙二醇。 此结果说明, 常见药剂中辅料成分及无机离子共存物质对于胱氨酸的检测几乎没有影响, 说明本方法选择性较好。

取市售胱氨酸片20片, 精密称定, 研细, 精密称取适量(约相当于胱氨酸80 mg), 按实验方法中的步骤, 制备成FANC溶液, 于荧光分光光度计上测定荧光强度。 按其回归方程计算样品百分标示量, 结果见表1。 将该荧光法测定所得结果与药典中氧化还原滴定法^[2]相比较, 效果满意。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 胱氨酸片含量测定结果(n=6) Table 1 Results of determination of cystine (n=6) Batch number Fluorimetric method (labeled amount/%) Oxidimetry method (labeled amount/%) A141116 105.25 103.23 A151019 98.67 99.72 A150301 93.38 95.27 A141105 101.17 103.76 A151019 99.03 102.31

表1 胱氨酸片含量测定结果(n=6) Table 1 Results of determination of cystine (n=6)