F-4500荧光仪(日本Hitachi), pH S-25酸度计(上海精科雷磁)。

1.00 mg· mL^-1琥珀酸曲格列汀(QGLT)标准溶液(江苏万川医疗健康产业集团有限公司提供的标准物质), 以高纯水为溶剂。

2.00 mg· mL^-1牛血清白蛋白标准溶液(BSA)(国药集团化学试剂有限公司), 以高纯水为溶剂。

pH值为7.4缓冲溶液: 称取3.4 g KH₂PO₄, 用适量水溶解, 再加入0.78 g NaOH, 用水溶解稀释至500 mL, 于酸度计上调节pH值为7.4。

琥珀酸曲格列汀片(江苏万川医疗健康产业集团有限公司提供): 规格: 100 mg· 片^-1, 批号: 20160701。

1.2.1 试样处理

QGLT药片: 取5片QGLT, 研成粉末后称取相当于一片重量的药品粉末, 用高纯水溶解定溶至100.0 mL, 过滤, 取续滤液供分析用。

人血清: 取健康自愿者的血清, 稀释10倍后测试。

1.2.2 荧光测定

于10 mL离心试管中, 分别加入0.20 mL 2.00 mg· mL^-1 BSA溶液、 2.0 mL pH值为7.4缓冲溶液、 一定量适量的QGLT样品或标准溶液, 用高纯水稀释至10.0 mL, 固定狭缝宽度为5.0 nm, 在激发波长280 nm时扫描所配制溶液的荧光发射峰, 测定荧光发射峰的强度。

BSA在280 nm激发时荧光发射峰位于340 nm附近, 而QGLT在340 nm无荧光。 图2为不同浓度QGLT存在时BSA的荧光谱图, 随着QGLT浓度增加BSA的荧光峰强度F逐渐降低, 据此可知QGLT对BSA的荧光强度产生了猝灭作用, 猝灭的原因可能是两者发生了相互作用。

图2

Fig.2

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图2 在QGLT存在下BSA的荧光谱图Fig.2 Fluorescence spectra of BSA in the presence of QGLT (cBSA: 40.0 μ g· mL-1, cQGLT is 0.00, 1.00, 3.00, 4.00, 5.00, 6.00, 8.00, 10.00 μ g· mL-1 from 1 to 8)

由图3可知荧光猝灭值Δ F(加与不加QGLT时BSA荧光峰强度差值)开始随pH值增大而增大, 在pH值为7.0~8.0范围内Δ F达到最大并基本保持不变, 之后随pH值增大Δ F下降, 故在以下实验中选用生理pH值(pH 7.4)作进一步研究。

图3

Fig.3

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图3 pH值对测定影响 cBSA: 40.0 μ g· mL-1, cQGLT: 2.0 μ g· mL-1)Fig.3 The influence of pH value on determination cBSA: 40.0 μ g· mL-1, cQGLT: 2.0 μ g· mL-1)

固定BSA、 QGLT浓度, 试验了pH值为7.4的NH₃-NH₄Cl、 柠檬酸-Na₂HPO₄、 KH₂PO₄-NaOH、 Tris-HCl缓冲体系对Δ F的影响, 结果显示介质对Δ F(加与不加QGLT时BSA荧光强度差值)无明显影响。 实验中选用KH₂PO₄-NaOH(人体中的缓冲体系)。

对缓冲溶液用量的影响进行了研究, 发现当溶液总体积为10.0 mL时, 其用量超过1.0 mL Δ F基本保持不变, 实验中选用缓冲溶液用量为2.0 mL。

图4

Fig.4

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图4 介质对荧光测定影响(cBSA: 40.0μ g· mL-1, cQGLT: 2.0 μ g· mL-1)Fig.4 Effect of medium on fluorescence determination(cBSA:40.0 μ g· mL-1, cQGLT: 2.0 μ g· mL-1) 1-NH3-NH4Cl, 2-Tris-HCl, 3-Citric acid-Na2HPO4, 4-KH2PO4-NaOH

2.4.1 荧光猝灭类型

一般荧光猝灭可分为动态和静态两种类型, 通过方程 F0/F=1+KsvcQ=Kqτ0cQ(Stern⁃Volmer方程, S—V方程)和 1/(F0-F)=1/F0+1/(KLBF0cQ)(Lineweaver⁃Burk方程, L—B方程)处理实验数据, 可了解荧光猝灭类型^{[7, 8, 9]}。

其中F₀和F: 加入猝灭剂前后体系的荧光强度; K_sv: 动态猝灭常数; K_q: 动态猝灭速率常数, 一般都小于2.0× 10¹⁰ L· (mol· s)^-1; τ ₀: 猝灭剂不存在时荧光分子平均寿命, 生物大分子τ ₀约为10^-8 s; c_Q: 猝灭剂浓度; K_LB: 静态猝灭结合常数。

如果荧光猝灭主要是通过单一动态猝灭进行, 在一定浓度范围内, F0/F~cQ曲线应有良好的线性关系; 如果猝灭作用主要是静态猝灭, 在一定浓度范围内, (F0-F)-1~cQ-1曲线应有良好的线性关系^[8]。

图5和表1为不同温度下BSA与QGLT作用的S— V曲线和L— B曲线及线性方程和相关系数。 根据表1计算出的K_q≈ 10¹²(> 10¹⁰)且L— B方程线性关系略优于S— V方程, 表明QGLT主要通过静态猝灭方式降低BSA的荧光强度^{[8, 9]}。

图5

Fig.5

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图5 不同温度时S— V(a) 与L-B(b) 曲线(cBSA: 40.0 μ g· mL-1)Fig.5 The S— V(a) and L— B(b) curves at different temperatures (cBSA: 40.0 μ g· mL-1)

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 不同温度时S— V和L— B曲线线性方程 Table 1 Linear equation of S— V and L— B curve at different temperatures 温度/℃ 回归方程 r 25 F0/F=1.024+1.977× 104cQGLT 0.996 (F0-F)-1=0.301 3+0.733 4× 10-5 cQGLT-1 0.999 30 F0/F=0.987+1.910× 104cQGLT 0.995 (F0-F)-1=0.079 3+1.223× 10-5 cQGLT-1 0.998 35 F0/F=0.974+1.889× 104cQGLT 0.998 (F0-F)-1=0.219 6+1.278× 10-5 cQGLT-1 0.998

表1 不同温度时S— V和L— B曲线线性方程 Table 1 Linear equation of S— V and L— B curve at different temperatures

由K_sv也可判断猝灭类型。 一般对于静态猝灭来说K_sv随温度升高而降低, 动态猝灭时正好相反^{[9, 10]}。 不同温度下测得QGLT与BSA作用的K_sv(L· mol^-1)为: 1.977× 10⁴(25 ℃), 1.910× 10⁴(30 ℃), 1.889× 10⁴(35 ℃)。 随着温度升高K_sv降低, 进一步说明QGLT可能与BSA结合发生了静态猝灭。

2.4.2 结合常数与结合位点数

根据文献[11], 荧光强度F与猝灭剂浓度c_Q满足下列关系

log(F0-F)/F=logK+nlogcQ

K与n即为反应的结合常数与结合位点数。 BSA与QGLT在不同温度时结合反应的K和n如表2所示。 n接近1, 表明BSA中可能有一个位点与QGLT结合, 而K随温度升高而降低, 表示BSA与QGLT形成的结合物稳定性可能随着温度升高而降低。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 结合常数与热力学参数 Table 2 The binding reaction constant and thermodynamic parameters 温度T(K) K(L· mol-1) n Δ Hθ (KJ· mol-1) Δ Sθ (J· mol-1)) Δ Gθ (KJ· mol-1) 298 303 4.529× 104 2.958× 104 1.05 1.02 -63.96 -125.5 -26.56 -25.93

表2 结合常数与热力学参数 Table 2 The binding reaction constant and thermodynamic parameters

2.4.3 热力学参数与作用过程

当温度变化不大时, 反应的焓变可认为是一常数, 根据 ΔG=ΔH-T·ΔS, ΔGθ=-RTlnKθ, ln(K2/K1)=(ΔHθ/R)·(1/T1-1/T2)可求得QGLT与BSA结合反应中的Δ H^θ , Δ G^θ 和Δ S^θ , 结果见表2。 Δ G^θ 为负值表示结合反应是自发进行的, 负的焓变与熵变说明了结合作用力主要是氢键和范德华力^[11]。

2.5.1 工作曲线与检出限

因为室温下Lineweaver-Burk曲线的线性关系更好, 实验中用该曲线测定QGLT含量。 曲线回归方程为: (F₀-

F)^-1 = 2.711× 10^-4+3.51× 10^-3 cQGLT-1(c_QGLT, 单位μ g· mL^-1), 相关系数r=0.998 9, 线性范围为0.5~10.0 μ g· mL^-1, 根据S/N=3计算出检出限为0.13 μ g· mL^-1。

2.5.2 回收率实验及样品测定

取QGLT药片溶液, 用高纯水稀释100倍后, 取2.00 mL溶液用所研究方法测定, 结果见表3。 将测定结果换算为每片含量为99.0 mg, 标示量为100 mg· 片^-1, 两者无显著性差异。 取10 mL离心管18支, 分别加入2.0 mL经稀释100倍后且已测定出含量的QGLT药片溶液及处理后的空白人血清溶液各9份, 然后加入QGLT标准溶液, 使其浓度分别为2.0, 4.0, 6.0 μ g· mL^-1, 每个浓度平行配制3份, 用所研究方法测定, 结果见表3, 回收率为94.0%~97.5%, 可见, 本法测定结果可靠, 且操作快速简便, 可用来测定药片及血清中琥珀酸曲格列汀含量。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 回收率及样品测定结果(n=3) Table 3 Recoveries and sample determination results (n=3) 样品 加入量 /(μ g· mL-1) 测定值 /(μ g· mL-1) 平均回收率 /% RSD/% QGLT药片 0.0 2.0 4.0 6.0 1.98 3.86 5.80 7.76 - 94.0 95.5 96.3 0.6 1.8 1.1 1.2 人血清 0.0 2.0 4.0 6.0 0.00 1.89 3.90 5.77 - 94.5 97.5 96.2 - 2.0 0.9 1.2

表3 回收率及样品测定结果(n=3) Table 3 Recoveries and sample determination results (n=3)