氙灯光源(HPX2000, 美国海洋公司); 激光光源(Fianium10-1820, 美国海洋公司); 检测器: 紫外-可见吸收光谱仪(岛津, UV-2550)。

维生素B₂(天津市福晨化学试剂厂, 批号: 20110921, 生物试剂); 罗丹明B (北京朝阳西会化工厂, 批号: 8701226, 分析纯); 异硫氰酸荧光素(北京博奥拓达科技有限公司, 批号: Sigma F7250); 荧光素(天津市福晨化学试剂厂, 批号: 20100802, 生物试剂); 二次蒸馏水。

精密称取罗丹明B、 荧光素、 维生素B₂各20 mg和异硫氰酸荧光素5.06 mg, 分别置于100 mL棕色容量瓶中, 分别用1%冰乙酸、 乙醇、 0.002 5 mol.L^-1氢氧化钠和1%冰乙酸溶解且定容至刻度, 超声15 min, 完全溶解, 依次得417.50, 602.39, 531.91和128.53 μ g.mL^-1储备液。

激光光源发出单色光, 氙灯光源发出复合光, 由于光在光纤内发生全反射, 从而激光和氙灯光经过样品室, 光纤在入射光90° 方位接受吸收光谱和荧光光谱, 并传送检测器, 在光纤中无损传输到达检测室^[5]。 在检测室中, 从光纤传达的激光和氙灯光经比色皿被待测物吸收部分光, 同时发出荧光, 基于入射光的垂直角度用另一支光纤将溶液发出的荧光无损传送到检测器中进行数据分析, 从而得出光谱图。 其中, 基于入射光正对面的聚光发色镜将出色光发射至溶液, 再次吸收激发光, 发出荧光, 从而增强光强度。

图1

Fig.1

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	图1 在线同步吸收-荧光检测系统Fig.1 Online synchronous absorption with fluorescence detection system

2.1.1 罗丹明B

罗丹明B又称玫瑰红B, 是一种人工合成染料。 其具有脂溶性, 被用作调味品染色剂。 按1.3方法操作, 用紫外-可见分光光谱法, 荧光分光光谱法, 在线荧光光谱法测定罗丹明B, 见图2光谱图所示。

图2

Fig.2

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	图2 三种方法测罗丹明B的光谱图谱Fig.2 Spectra of Rhodamine B measured by three methods (a): Ultraviolet visible light spectrum; (b): Fluorescence spectrum; (c): Online fluorescence spectra①: Laser online fluorescence spectrum; ②: Xenon lamp online fluorescence spectrum

2.1.2 维生素B₂

维生素B₂微溶于水, 为体内黄酶类辅基的组成部分, 当缺乏时, 就影响机体的生物氧化, 使代谢发生障碍^[6]。 按1.3方法操作, 用紫外-可见分光光谱法, 荧光分光光谱法, 在线荧光光谱法测定维生素B₂, 见图3光谱图所示。

图3

Fig.3

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	图3 三种方法测维生素B2的光谱图谱Fig.3 Spectra of Vitamin B2 measured by three methods (a): Ultraviolet visible light spectrum; (b): Fluorescence spectrum; (c): Online fluorescence spectra①: Laser online fluorescence spectrum; ②: Xenon lamp online fluorescence spectrum

2.1.3 荧光素

荧光素是发光物质的基质。 用作化学分析的指示剂、 生物染色剂和化妆品着色剂, 使许多生物具有荧光的物质。 按1.3方法操作, 用紫外-可见分光光谱法, 荧光分光光谱法, 在线荧光光谱法测定荧光素, 见图4光谱图所示。

图4

Fig.4

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	图4 三种方法测荧光素的光谱图谱Fig.4 Spectra of fluorescein measured by three methods (a): Ultraviolet visible light spectrum; (b): Fluorescence spectrum; (c): Online fluorescence spectra①: Laser online fluorescence spectrum; ②: Xenon lamp online fluorescence spectrum

2.1.4 异硫氰酸荧光素

异硫氰酸荧光素能和各种抗体蛋白结合, 结合后的抗体不丧失与一定抗原结合的特异性, 并在碱性溶液中具有强烈的绿色荧光, 用于医学, 农学和畜牧等方面^[7]。 按1.3方法操作, 用紫外-可见分光光谱法, 荧光分光光谱法, 在线荧光光谱法测定异硫氰酸荧光素, 见图5光谱图所示。

图5

Fig.5

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	图5 三种方法测异硫氰酸荧光素的光谱图谱Fig.5 Spectra of fluorescein isothiocyanate measured by three methods (a): Ultraviolet visible light spectrum; (b): Fluorescence spectrum; (c): Online fluorescence spectra①: laser online fluorescence spectrum; ②: Xenon lamp online fluorescence spectrum

图6

Fig.6

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	图6 化学结构图 ①: 罗丹明B; ②: 维生素B2; ③: 荧光素; ④: 异氰硫酸荧光素Fig.6 Pharmaceutical chemical structure ①: Rhodamine B; ②: Vitamin B2; ③: Fluorescein; ④: Different hydrogen sulfate fluorescein

由图2— 图5可以知道, 罗丹明B、 维生素B₂、 荧光素和异硫氰酸荧光素浓度均为10 μ g· mL^-1, 积分时间100 ms, 测定3次得其平均值。 紫外-可见分光光度法, 荧光分光光度法, 利用激光光源和氙灯光源的在线荧光光谱法测定的吸收波长, 发射波长见表1所示。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 四种药品的吸收, 激发和发射波长 Table 1 The absorption, excitation and emission wavelength of four drugs UV Spectrofluorimetry Online absorb fluorescence Laser light sources Xenon lamp light source Absorption wavelength/nm Excitation wavelength /nm Emmision wavelength /nm Excitatin wavelength /nm Emmision wavelength /nm Regression equation R Regression equation R Rhodamine B 577, 402, 352, 284 577 586 580 594 Y=4 593x+825.60 0.998 5 Y=2 150.89x+2 445 0.999 1 Vitamin B2 441, 356, 269, 220 443 520 450 530 Y=13.53x+27.40 0.998 9 Y=9.09x+18.56 0.999 6 Fluorescein 483, 456, 277 443 519 443 488 Y=-520x+24 591 0.999 1 Y=-183x+8 793.5 0.999 7 Different hydrogen sulfate fluorescein 498, 320, 284, 245 498 520 580 594 Y=-402.94x+1 748 0.998 9 Y=-9.57x+18.80 0.999 6

表1 四种药品的吸收, 激发和发射波长 Table 1 The absorption, excitation and emission wavelength of four drugs

罗丹明B、 维生素B₂、 荧光素和异硫氰酸荧光素浓度均为10 μ g· mL^-1, 积分时间100 ms, 选用最佳激发波长和发射波长测定激光光源和氙灯光源产生的荧光光强度, 分别测定3次, 取其平均值, 结果见表2所示。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 激光光源光强和氙灯光源强度 Table 2 Light intensity of laser light sources and xenon lamp light source Concentration/(μ g· mL-1) Rhodamine B Vitamin B2 Fluorescein Different hydrogen sulfate fluorescein Laser light sources 10 56 021.62 4 260.07 18 832.67 13 456.93 Xenon lamp light source 10 24 289.45 1 312.13 6 660.10 5 401.82

表2 激光光源光强和氙灯光源强度 Table 2 Light intensity of laser light sources and xenon lamp light source

由表1可以看出, 罗丹明B的激光光源产生的发射光强度是氙灯光源的2.31倍。 维生素B₂的激光光源产生的发射光强度是氙灯光源的3.22倍, 荧光素的激光光源产生的发射光强度是氙灯光源的2.83倍, 异硫氰酸荧光素的激光光源产生的发射光强度是氙灯光源的2.49倍。 荧光光强度正比于被荧光物质的吸收光强度, 即

F=K(I0-I)(1)

K为常数, 其值取决于荧光效率。 根据Lambert-Beer定律

I=I010-Ecl(2)

将式(2)代入式(1), 得到

F=KI0(1-10-Ecl)(3)

罗丹明B、 维生素B₂、 荧光素、 异硫氰酸荧光素在同一条件下荧光光强度大小与吸光系数、 入射光强度有关。 荧光光强度与入射光强度成正比, 入射光强度愈大, 荧光光强度愈大。

罗丹明B、 维生素B₂、 荧光素和异硫氰酸荧光素激光光源在线吸收-荧光光谱测定光强度都大于相应氙灯光源在线吸收-荧光光谱测定光强度, 而且激光光源和氙灯光源测定的光强度大小顺序都是罗丹明B> 荧光素> 异硫氰酸荧光素> 维生素B₂。 原因不仅与光源有关, 而且与吸光系数有关。 经查阅文献可知荧光物质吸光系数与物质分子的共轭体系大小、 共轭大π 键的共平面性及其刚性程度、 分子母体上取代基的种类有关^[8]。 分子所处的外界环境如温度、 溶剂、 溶液酸碱度、 激发光的照射等环境因素也会影响荧光效率。

2.2.1 溶剂效应

通常光强度随着溶剂极性的增强而增大, 荧光峰的波长随着溶剂介电常数的增大而增大。 罗丹明B、 维生素B₂、 荧光素、 异氰硫酸荧光素的溶剂分别为1% 醋酸水溶液、 0.002 5 mol· L^-1氢氧化钠水溶液、 乙醇和0.002 5 mol· L^-1氢氧化钠水溶液。 溶剂极性大小为: 1% 醋酸水溶液> 0.002 5 mol· L^-1氢氧化钠溶液> 乙醇。 罗丹明B在中性和酸性条件下, 以醌式存在, 在碱性条件下则是以内酯形式存在。 在1% 醋酸水溶液中醌式结构形式存在的罗丹明B吸收可见光后会发射出很强的荧光。

2.2.2 酸碱度的影响

溶液酸碱度轻微的变化往往会对激光和氙灯光产生明显的影响, 罗丹明B分子含有羧基和季氨取代基, 具有很强的光强性。 荧光素和异氰硫酸荧光素具有两个酚羟基, 具有酸性。 维生素B₂的羟基具有弱酸性。 酸性强度大小是分子内含有羧基> 酚羟基> 羟基。

2.2.3 共轭效应的影响

分子共轭体系对激光光源和氙灯光源的影响通常发生于具有共轭双键体系的分子。 一般来说, 芳香环数越多, 共轭体系越大, 荧光就越强。 罗丹明B、 荧光素、 异硫氰酸荧光素含有芳香环不低于两个, 维生素B₂只有一个芳香环。

2.2.4 共平面性及其刚性程度的影响

具有π 电子共轭体系分子的平面性增加, π 电子的非定域性就增加, 荧光效率也将增大。 氧桥键把两个苯环固定在一个平面上, 使分子具有刚性共平面结构, 有利于荧光的产生。 罗丹明B, 荧光素和异氰硫酸荧光素的结构均具有氧桥键, 因此激光光源和氙灯光源强度远远大于维生素B₂。

2.2.5 取代基的影响

给电子基团增强荧光性能, 而吸电子基团降低荧光强度, 维生素B₂有两个给电子基团和四个吸电子基团, 罗丹明有四个给电子基团和两个吸电子基团。 荧光素和异硫氰酸荧光素有两个给电子基团, 异硫氰酸荧光素比荧光素多一个巯基, 巯基属于吸电子基团, 所以荧光素的光强度比异硫氰酸荧光素强。